• Название:

    Лекция 3=Проточная цитометрия — презентация

  • Размер: 4.17 Мб
  • Формат: PPT
  • или
ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ FLOW CYTOMETRY ЛЕКЦИЯ 3 Проточная цитометрия – исследователь-ская технология, позволяющая на основеизмерений оптических параметров, охаракте-ризовать физические и биохимические свой-ства клеток.
В ходе анализа одновременно производят фотометрию и флуориметриюотдельных клеток, которые в составе лами-нарного потока жидкости поочерёдно пересе-кают монохроматический световой поток, создаваемый лазером. Гелий-неоновый лазер, l = 633 nm (красный) Аргоновый лазер, l = 488 nm Гелий-кадмиевый лазер, l около 400 nm (УФ) Принцип проточной цитометрии (подсчет клеток крови) был запатентован в 1953 году в США Уоллесом Коултером (Wallace H. Coulter). Первая лабораторная установка для реги-страции флуоресценции потока клеток из первичной суспензии создана в 1968 году Вольфгангом Гёде (Wolfgang Gцhde) в Уни-верситете Мюнстера (Германии). На три года раньше, в 1965 году Марк Фульвейлер (Mack Fulwyler) разработал устройство, позволяющее разделять суспен-зию клеток по их электрическому заряду.
Этот методический подход широко исполь-зуется и сегодня.
Разделение (сортировка) исходной суспензии клеток на три фракции по их электрическому заряду: электростатическое отклонение Суспензия изучаемых клеток Лазер Каналфлуресценции Канал светорассе-ивания Катод (-) Анод (+) клетки, -q клетки, +q клетки электронейтральные В 1969 году был выпущен первый серийный проточный цитометр в форме приставки к флуоресцентному микроскопу фирмы «Zeiss». С 1970 года в цитометре стали использо-вать гелий-неоновый лазер с излучением, l = 633 нм. («Cytograph»).
Этот прибор позволял быстро разделить изучаемую суспензию клеток на живые и погибшие клетки по вклю-чению в погибшие клетки красителя трипа-нового синего.
Позже прибор был усовершен-ствован благодаря использованию аргоно-вого лазера, l = 488 нм. («Cytofluorograph»). Термин «проточная цитометрия» («flow cyto-metry») был предложен на международной конференции «The Conference of the American Engineering Foundation in Pensacola, Florida» в 1976 году. С тех пор этот термин утвердился во всем мире. Иногда можно встретить термин проточная цитофлуориметрия. Этот термин не корректный, поскольку одно-временно измеряется не только флуоресцен-ция, но и интенсивность рассеянного светово-го потока. Проточная цитометрия позволяет охаракте-ризовать физические и биохимические свой-ства суспензии клеток в диапазоне их разме-ров от 0,2 до 150 mm.
Преимущества метода проточной цитометрии:
Короткое время анализа (за счет высокой скорости движения клеток по капилляру, до 1000 клеток/с);
2. Анализ большого количества клеток (до 108 клеток);
3. Высокая точность измерения интенсивности флуо- ресценции и светорассеивания. Образцами являются: костный мозг, ликвор, сустав-ная, плевральная или асцитическая жидкости, а также суспендированные клетки крови и различных тканей. В ходе анализа возможно определять 5-10 различ-ных параметров клетки: размер, содержание ДНК, белков (цитокинов, транскрипционных факоров) и липидов, антигенные свойства и активность фермен-тов, а также возможны исследование клеточного цикла, мониторинг состояния вирусного процесса, количественный анализ внутриклеточных компонен-тов и количественные измерения путем дифференци-ровки интенсивности рассеяния / флуоресценции при различных длинах волн. Проточная цитометрия в её современных вариан-тах - мультипараметрический анализ. Это позволяет минимизировать необходимый объем биологического материала (до 100 мкл), сни-зить время пробоподготовки и фактического анали-за, сокращая тем самым, путь от получения образца до клинической интерпретации результата – ответа лаборатории клинике. Луч лазера одновременно: 1. Рассеивается клетками: малоугловое (пря-мое) светорассеивание (угол ок. 10о, если Ш клетки ≈ l) и боковое светорассеяние (угол ок. 90о, если Ш клетки < l).
Интенсивность светорассеяния измеряют с помощью фотометрического оптического канала. 2. Возбуждает флуоресценцию: собственная (аутофлуоресценция) и после предвари-тельной обработки клеток одним или несколь-кими флуоресцентными красителями, либо МКА, конъюгированными с молекулой флуо-рохрома.
Интенсивность флуоресценции измеряют с помощью флуоресцентного опти-ческого канала. side scatter forward scatter лазер Клетка, пересекающаялазерный луч ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ светорассеивание Измерениеинтенсивности флуоресценции Измерение интенсивности рассеянного света Два световых потока, образующихся при пересечении клеткой лазерного луча Флуоресценция может быть, как собственная (аутофлуоресценция),так и за счёт обработки клетокразличными специальными флу-оресцентными красителями. Принципиальное устройство проточного цитометра (flow cytometer) Лазер Устройство для созданияламинарного потока клеток изучаемой суспензии (гидро-динамическое фокусирование) Лазерный луч Оптическая система Датчики, преобразующиесветовые потоки в электрические импульсы Компьютер Поток клеток Поток рассеяного света флуоресценция 1. Устройство для формирования ламинарного потока изучаемых клеток:гидродинамическая фокусировка – струяв струе Изотоничныйи забуференныйсолевой раствор Суспензия изучаемых клеток Суспензия изучаемых клеток Изотоничныйи забуференныйсолевой раствор Кварцевая проточная кювета (в форме капилляра):скорость по-тока 30 м/с Луч лазера(сфокуси-рованный) флуоресценция светорассеивание Датчик для измеренияинтенсивности флуоресценции Датчик для измеренияинтенсивности рассеянного света 1. Устройство для формирования ламинарного потока изучаемых клеток:гидродинамическая фокусировка – струяв струе Прошедший световой поток ФЭУ ФЭУ 2. Оптическая система для регистрации интен-сивности рассеянного светового потока Измерение интенсивности рассеянного клетками светового потока от лазера позволяет:а). сосчитать клетки;б). определить их размер (по прямому / малоугло- вому светорассеиванию;
Чем больше размер клетки (диаметр), тем сильнее будет свето-рассеивание.
Лазерное излучение Боковое светорассеивание(угол около 90о) Прямо светорассеивание(угол около 10о) Прямое и боковое светорассеивание лазерного луча клеткой Представление распределения клеток изучаемой суспензии по их размерам (гистограмма распределения) Количество клеток Размер клеток, mm Повышение чувствительности цитометрического анализа суспензии клеток крови, обозначением порога чувствительности 1 2 3 в). одновременное измерение прямого и бокового светорассеяния, без окраски клеток флуорес- центными красителями, позволяет выделить все клеточные субпопуляции лейкоцитов (в основ- ном, по степени гранулярности их цитоплазмы): лимфоциты, моноциты и гранулоциты.
Нейтрофилы Моноциты Лимфоциты Прямое светорассеивание Боковое светорассеивание Частотная гистограмма распреде-ления:по «Х» - шкала интенсивности;по «У» - к-во клеток с данным зна- чением параметра Получение двумернойдиаграммы из двуходномерных диаграмм Субпопуляции лейкоцитов крови, выявляемые по степени гранулярности цитоплазмы (одномерный график на основе измерениябокового светорассеивания):
Нейтрофил( ) Проточно-цитометрический анализ мононуклеарных клеток периферической крови пациента с В-клеточным хроническим лимфолейкозом (двумерная диаграмма) Прямое светорассеивание Боковое светорассеивание Популяция злокачественных клеток 3. Оптическая система для измерения интенсивности как собственной флуоресценции клеток, так и пос- ле их предварительного окрашивания флуресцент- ым(и) красителем(ями). В настоящее время синтезированы флуоресцен-тные красители, которые имеют максимумы возбу-ждения в диапазое l 400 - 650 нм. Их флуоресцен-ция (вторичный световой поток) имеет определен-ную длину волны.
Часто изучаемые клетки окраши-вают сразу несколькими красителями.
Как резуль-тат – флуоресценция (вторичный световой поток) является полихромным.
Оптический канал позво-ляет выделить из общего потока флуоресценции все его составляющие (каждый из которых имеет определенную длину волны) и измерить их интен-сивность. Одновременное измерение интенсивности флуорес-ценции восьми различных флуоресцентных красителей, которым были обработаны изучаемые клетки Полихромный флуоресценцентный световой поток Прямое светорассеяние Флуорохромы (флуоресцентные красители): флюо-ресцеинизотиоцинат (FITC, lфлуор.= 530 nm), тетраме-тил-родамин (TRITC), фикоэритрин (PE, lфлуор.= 585 nm), белок хлорофилла – перидинхлорофилл протеин (Per Cp, lфлуор. = 650 nm), алло-фикоцианин (АРС, lфлуор.= 661 nm), тандем цианин-5/фикоэритрин (Cy5/PE, lфлуор.= 670 nm) и др. Наиболее распространенным является использо-вание 2 - 4-х флуоресцентных меток (при наличии нескольких лазеров в приборе).
Возбужденные лазерным лучом флюоресцентные красители, генери-руют вторичные световые потоки (имеющие различ-ные l = различные цвета), что позволяет определять 2 или 3 антигена одновременно. Флуоресцентные красители для обработки клеток (иммунофлуоресцентное мечение) Спектральные характеристики некоторых современных флуоресцентных красителей для проточной цитометрии Моноклональное антитело (МКА),конъюгирован-ное с флуорес-центным красите-лем (флуоресцеин изотиоцианат, ФИТЦ ).
Клетки, с экспрессией соответствующих антигенов на поверхности, связывают эти МКА и начинают флуоресцировать.
Принцип выявления клеточных маркёров с помощью меченых флуорохромами моноклональ-ных антител (МКА) Интенсивность флуоресценции пропорциональна количеству ФИТЦ-меченых МКА, связавшихся с клеткой Информация, получаемая на основе анализа флуоресценции клеток 1. Измерение содержания различных пигментов (хлорофилл);
2. Сортировка клеток по содержанию ДНК и РНК, в том числе изучение фаз клеточного цикла;
3. Определение количества копий ДНК в клетке;
4. Сортировка клеток по содержанию РНК;
5. Изучение структуры хромосом;
6. Изучение экспрессии белков и их локализацию;
7. Сортировка клеток по содержанию в них трансгеных продуктов (белок зеленой флуоресценции – green fluorescenece protein) и др.);
8. Изучение внутриклеточного содержания цитокинов или вторич- ных мессенджеров;
9. Выявление клеток, имеющих поверхностные антигены;
10. Измерение ферментативной активности;
11. Определение жизнеспособности клеток;
12. Оценка «дыхательного взрыва» макрофагов;
13. Оценка устойчивости опухолевых клеток к хемиотерапевти- ческим препаратам и др. Метод сортировки клеток суспензии на основе регистрации их флуоресценции после окрашивания флуресцентными красителями – получил название FACS analysis (fluorescence activated cell sorting).
Меченые различными флуор-охромами МАК связываются со«своими» поверхностными антигенами.
В итоге:CD80+ клетки дают красную флуоресценцию;CD14+ клетки – зелёную флуо-ресценцию.
Результирующий график сортировки клеток по экспрессии поверхностных антигенов CD14 и CD80 CD14 маркер клеток миелоидного ряда (макрофагов), распознающих бактериальный ЛПС СD80 – маркер активиро-ванных В-клеток Результирующая гистограмма количественного распределения CD80 и CD14 клеток по интенсивности флуоресценции Пример иммуно-фенотипического анализа клеток с использованием проточной цитометрии Число клеток с определенной интенсивностью флюоресценции Ядро Выявление апоптоза клеток по изменениям структуры плазматической мембраны методом проточной цитометрии с применением ФИТЦ и PI Аннексин V – белок с высоким сродством к фосфатидилсерину. Используют конъюгат Аннексин V-ФИТЦ. Propidium Iodide (PI) – флуоресцентный краситель, связывающий- ся с ДНК или её фрагментами. Аннексин V-ФИТЦ Фосфатидилсерин(ФС) Экстернализация ФС – - сигнал для макрофагов:«ешь меня» Результат выявления проточной цитометрией апоптозных клеток с использованием двух флуорфоров Живые клетки Апоптозныеклетки Мёртвыеклетки Суммарный % апоптозныхи мёртвых клеток Проточная цитометрия - ведущий метод в клиничес-кой иммунологии и гематологии.
Метод используют для решения следующих задач: иммунофенотипирования лимфоцитов, включая определение количества CD4, CD8 клеток и даже ТН1 и ТН2 (по продукции специфических цитокинов); анализа процессов клеточной активации на основе определения маркеров ранней активации: CD25 (рецептор интерлейкина-2), CD38, CD69, CD71 (трансферриновый рецептор), CD95 (антиген апоптоза), CD122, анти-HLA-DR; определения маркеров пролиферативной активности клеток иммунной системы (Ki-67, PCNA, Cyclin D3); оценки внутриклеточной продукции цитокинов различными клеточными популяциями; иммунофенотипирования острых лейкозов и лимфом; анализа клеточного цикла с определением распределения кле- точной популяции по фазам цикла (ДНК-цитометрия); анализа маркеров апоптоза (аннексина V, CD95 Fas/APO-1, CD95 L, Bcl-2, P53).
Области применения проточной цитометрии Иммунология Иммунофенотипирование клеток крови;
Определение фагоцитарной активности;  Определение внутриклеточных цитокинов и различ- ных внутриклеточных белков (например транскрип- ционных факторов); Определение пролиферативной активности ;
Исследование клеточного цикла;
Оценка клеточной цитотоксичности;
Трансплантационный мониторинг.
Онкология Количественный анализ внутриклеточных компо- нентов (ДНК);
Анализ стадий клеточного цикла;
Определение специфических маркеров;
Наблюдать пациентов, входящих в группу риска; Оценка состояния иммунной системы;
Оценка клеточного звена иммунитета (определение субпопуляций лимфоцитов);
Оценка функциональной состоятельности иммуно- компетентных клеток (NK тест, фагоцитарный тест и т. п.).
Цитология Определение цитоморфологических характеристик клетки: размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток;
Оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов;
Определение экспрессии поверхностных антиге- нов;
Анализ стадий клеточного цикла; Измерение физиологических параметров клетки (внутриклеточный p H, концентрация ионов Ca2+, потенциал клеточной мембраны).
Гематология Анализ субпопуляционного состава клеток крови;
Подсчет ретикулоцитов, анализ тромбоцитов по специфическим маркерам;
Диагностика и дифференциальная диагностика лимфопролиферативных заболеваний; Диагностика острых лейкозов.
Клеточная биология, биохимия Измерение экспрессии маркеров;
Измерение активности внутриклеточных фермен- тов;
Определений стадий клеточного цикла при изуче- нии механизмов действия БАВ на клеточном уровне. Разнообразие вариантов использования проточной цитометрии на сегодняшний день может быть ограничено только фантазией исследователя, а в диагностической службе – аналитическими потребностями клиники.