патент перевод в pdf

Формат документа: pdf
Размер документа: 1.6 Мб




Прямая ссылка будет доступна
примерно через: 45 сек.



  • Сообщить о нарушении / Abuse
    Все документы на сайте взяты из открытых источников, которые размещаются пользователями. Приносим свои глубочайшие извинения, если Ваш документ был опубликован без Вашего на то согласия.

1

US010130701B2
(12) Патент США.
Бикертон и др.
(io) Номер патента: US 10,130,701 B2
(45) Дата патента:Nov. 20, 2018
(54) КОРОНАВИРУС
(71) Заявитель: ИНСТИТУТ ПРАВО,
Пирбрайт, Уокинг (Великобритания) (72) Изобретатели: Эрика Бикертон, Уокинг
(Великобритания); Сара Keep, Уокинг (Великобритания); Пол Бриттон, Уокинг (ГБ) (73) Правопреемник: ИНСТИТУТ ПРАВО,
Уокинг, Пирбрайт (Великобритания) (*) Уведомление: в соответствии с любым отказом от
ответственности патент продлен или скорректирован до 35 лет
USC 154 (b) на 0 дней. (21) Прил. №: 15/328 179 (22) Подано PCT: 23 июля 2015 г.
(86) Номер РСТ: PCT / GB 2015 / 052124 § 371 ( c) (1), (2) Дата :Jan. 23, 2017
(87) PCT Pub. №: WO2016 / 012793 PCT Pub. Дата: Январь 28, 2016
(65) Данные предыдущей публикации US 2017/0216427 Al 3 августа 2017 г. (30) Данные о приоритете иностранных приложений
23 июля 2014 г. (Великобритания) .................................... 1413020,7 (51) Инт . Cl.
A61K 39/215 (2006.01) C12N 7/00 (2006.01) C12N 9/12 (2006.01)
A61K 39/00 (2006.01) (52) Кл .КТК ... A61K 39/215 (2013.01); C12N 7/00
(2013.01); C12N 9/127 (2013.01); C12Y207/07048 (2013.01); A61K 2039/5254 (2013.01); A61K 2039/54 (2013.01); C12N
2770/20021 (2013.01); C12N 2770/20022 (2013.01); C12N 2770/20034 (2013.01); C12N 2770/20051 (2013.01); C12N 2770/20062 (2013.01)
(58) Поле классификационного поиска КТК ........................................... A61K 39/215
См. Файл приложения для полной истории поиска. (56) Цитированные ссылки
ПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ США 7,452,542 B2 * 11/2008 Денисон ............... C07K 14/005 424 / 221,1
ЗАРУБЕЖНЫЕ ПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ WO WO -2004/092360 A2 10/2004
WO WO -2005/049814 A2 6/2005 WO WO -2007/078203 Al 7/2007
WO WO -2011/004146 Al 1/2011 ДРУГИЕ ПУБЛИКАЦИИ
Журнал вирусологии Сперри, 2005, т. 79, No. 6, pp. 3391 -3400. * Альтшул и др., Базовый инструмент поиска локального
совмещения. J. Mol. Биол. 215:403 -10 (1990). Ammayapppan et al., Идентификация изменений последовательности ответа
Способен ослаблять штамм вируса инфекционного бронхита птиц Арканзас DPI, Arch. Virol., 154 (3): 495 -9 (2009).
Аноним: «EM_STD: KF377577», 30 октября 2013 г. Armesto et al., Рекомбинантный вирус птичьего
инфекционного бронхита. экспрессия гетерологичного гена шипа, принадлежащего серотипу 4/91,PLoS One, 6 (8): e24352 (2011) .
Armesto et al., Ген репликазы инфекционного коронавируса птиц.
Вирус бронхита является определяющим фактором патогенности, PLoS One,4 (10): e7384 (2009).
Armesto et al., Временный доминантный отбор для модификации и создание рекомбинантных коронавирусов инфекционного бронхита,Методы Мол . Биол ., 454: 255 -73
(2008). Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 4 -е издание ,
Глава 18 (1999). Бриттон и др., Создание рекомбинантного птичьего
коронавируса вирус инфекционного бронхита с использованием преходящей доминантной селекции, J.Virol. Методы, 123 (2):
203 -1 1 (2005). Бриттон и др., Модификация инфекционного птичьего
коронавируса вирус б ронхита для разработки вакцины, Bioeng. Ошибок., 3 (2): 114 -9(2012).
Casais et al., Рекомбинантный вирус инфекц ионного бронхита птиц, экспресс генерация ге терологичного спайка демонстрирует, что белок спайка детерминанта клеточного
тропизма, J. Virol., 77 (16): 9084 -9 (2003). Casais et al., Сис тема обратной генетики птичьего
коронавируса вирус инфекционного бронх ита, J. Virol., 75 (24): 12359 -69 (2001).
Devereux et al., Комплексный набор программ анализа последовательностей
для VAX. Nucl. Acids Res., 12: 387 -95 (1984). Кавана и др., Манипуляция коронавирусом инфекционного
бронхита геном для разработки вакцины и анализ аксессуара белки, Vaccine, 25 (30): 5558 -62 (2007).
Международный предварительный отчет о патентоспособности, международная заявка
катион № PCT / GB2015 / 052124 от 24 января 2017 г. Отчет о международном поиске и письменное заключение,
международны й Заявка № PCT / GB2015 / 052124 от 9 октября 2015 г. Ларкин и др., Clustal W и Clustal X версия 2.0,
Биоинформатика, 23 (21): 2947 -8 (2007).
Menachery et al., Ослабление и восстановление тяжелой острой мутант коронавируса респираторного синдрома без 2' -o- активность метилтрансферазы, J. Virol., 88 (8): 4251 -64 (2014).
Татусова и др., BLAST 2 Sequences, новый инструмент для сравнения
белковые и нуклеотидные последовательности, FEMS Microbiol. Lett., 174 (2): 247 -
50 (1999). (Продолжение) Главный экзаменатор - Бао Цюй Ли
(74) Поверенный, агент или фирма - Marshall, Gerstein & ТОО «Борун»
(57) АННОТАЦИЯ Настоящее изобретение обеспечивает живой ослабленный
коронавирус. rus, содержащий вариантный ген репликазы, кодирующий
полипро teins, содержащие мутацию в одном или нескольких неструктурных
белок (белки) (nsp) -10, nsp -14, nsp -15 или nsp -16. Корона вирус может использоваться в качестве вакцины для лечения и
/ или предотвращения заболевание, такое как инфекционный бронхит, у субъекта.
25 требований, 15 лист ов чертежей Спецификация включает Список последовательностей.

Страница 2
США 10 130 701 B2 (56)
Цитированные ссылки Страница 2 ДРУГИЕ ПУБЛИКАЦИИ
Ван и др., Ослабление репродуктивной и респираторной функции свиней.
штамм вируса синдрома MN184 с использованием химерной конструкции с последовательность вакцины, Virology, 371 (2): 418 -29 (2008).
Wei et al., Разработка и характеристика рекомбинантного

2

вирус инфекционного бронхита, экспрессирующий область эктодомена SI
ген штамма H120, Appl. Microbiol. Биотехнология, 98 (4): 1727 - 35. (2014).
* цитируется экспертом

Стр. 3
Патент США Nov. 20, 2018 Лист 1 из 15 США 10 130 701 B2 РИСУНОК 1


Стр. 4
Патент США Nov. 20, 2018 Лист 2 из 15 США 10 130 701 B2


Стр. 5
Патент США Nov. 20, 2018 Лист 3 из 15 США 10 130 701 B2
РИСУНОК 3 Оценка цилиарной активности

активность

Стр. 6
Патент США Nov. 20, 2018 Лист 4 из 15 США 10 130 701 B2 РИСУНОК 4


Стр.7
Патент США Nov. 20, 2018 Лист 5 из 15 США 10 130 701 B2 РИСУНОК 5

3




Стр. 8
Патент США Nov. 20, 2018 Лист 6 из 15 США 10 130 701 B2 РИСУНОК 6


Стр.9
Патент США Nov. 20, 2018 Лист 7 из 15 США 10 130 701 B2 РИСУНОК 7
Стр.10
Патент США 20 ноября 2018 г. Лист 8 из 15 США 10 130 701 B2




Стр. 11
Патент США Nov. 20, 2018 Лист 9 из 15 США 10 130 701 B2 РИСУНОК 9

4










Стр.12
Патент США Nov. 20, 2018 Лист 10 из 15 США 10 130 701 B2













Стр. 13
Патент США Ое нояб 20, 2018 Лист 11 из 15 США 10 130 701 B2

5




Стр. 14
Патент США Ое нояб 20, +2018 Лист 12 из 15 США 10 130 701 B2



Стр. 15
Патент США Ое нояб 20, +2018 Лист 13 из 15 США 10 130 701 B2

Стр.16
Патент США Nov. 20, 2018 Лист 14 из 15 США 10 130 701 B2 Рис. 11B

6




Стр.17
Патент США Ое нояб 20, 2018 Лист 15 из 15 США 10 130 701 B2 Рис. 11C
Гей 4 6 день

7












Стр.18
США 10 130 701 B2 1
КОРОНАВИРУС
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ
ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к аттенуированному
коронавирусу. Содержащий вариантный ген replicase , который вызыв ает вирус име ет пониженную патогенность. Настоящее изобретение также относится к использованию такого коронавируса в вакцине , отрицательно
предотвратить и / или лечить заболевание.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Вирус инфекционного бронхита птиц (ИБК), этиологический возбудитель инфекционного бронхита (ИБ), является очень заразным и заразный возбудитель домашней птицы,
воспроизводящий при дыхательных путях, но также и в эпителиальных клетках кишечник, почки и яйцеводы. IBV
является членом Ордена Nidovirales, семейство Coronaviridae, подсемейство Corona viri -nae род Gammacoronavirus; генетически очень похожи
коронавирусы вызывают заболевания у индеек, цесарок и фазаны.
Клинические признаки ИБ включают чихание, трахеальные хрипы, носовые выделения и хрипы. Птицы мясного типа
уменьшили набор веса, в то время как яйцекладущие птицы откладывают меньше яиц и произв одить некачественные яйца. Предрасположенность к респираторной инфекции.
подвергает цыплят вторичным бактериальным инфекциям, которые могут быть фатальным для цыплят. Вирус также
может вызывать постоянное повреждение яйцевода, особенно у цыплят, что привод ит к снижению яйценоскости и
каче ства; почки, иногда приводит к заболеванию почек, которое может быть фатальным. Сообщается, что IBV несет ущерб больше экологический .
Номинальный ущерб птицеводству больше, чем от любой другой инфекционной болезни . Хотя жи вые аттенуированные
вакцины и инактивированные вакцины повсеместно используются для борьбы с ИБК,защита, полученная с
помощью вакцинации, может быть потеряна из -за к распада вакцины или появлению нового ИБК серотип, не связанный с используемой вакциной, чт о создает риск птицеводству.
Кроме того, в отрасли существует потребность в разработке вакцин которые подходят для использования in ovo, чтобы
улучшить эффективность и экономичность вакцинации pro граммы. Основная проблема, связанная с вакциной инновация заключается в том, что вирус должно быть способен
размножаться в наличие материнских антител против вируса,
не являясь патогенными для эмбриона. Текущий пылесос IBV Кины образуютс я после многократного пассажа в
зародышевых яйца х, это приводит к появлению вирусов с пониженной патогенностью для цыплят, чтобы их можно было использовать в качестве живых аттенуированных вак
кино. Однако такие вирусы почти всегда проявляют повышенная вирулентность для эмбрионов и поэтому не
может использоваться для вакцинации i n ova, поскольку они вызывают снижение выводимости. А В некоторых случаях
наблюдается снижение выводимости на 70%. Затухание после многократного пассажа у зародышей яйца также страдают другими недостатками. Это эмпирический
метод, так как ослабление вирусо в является случайным и будет различа тся каждый раз при прохождении вируса,
поэтому прохождение тот же вирус через другую серию яиц для ослабления цели приведут к другому набору мутаций, ведущих к затуханию . Есть также проблемы с
эффективностью, связанные с процесс: некоторые мутации повлияют на репликацию вирус а и некоторые мутации могут
сделать вирус тоже ослабленным . Мутации также могут происходить в гене S, который может также повлиять на
иммуногенность, так что желаемый иммунный ответ затронут, и потенц иальная вакцина может не защитить от необходимого серотипа. Вдобавок есть проблемы, связанные с
возвращением к вирулентности и стабильности вакцин.
2 Важно разработать новые и более безопасные вакцины.
для борьбы с ИБК. Таким образом, существует потребность в вакцинах против ИБК.которые не связаны с этими
проблемами, в частности вакцины, которые можно использовать для вакцинации in ovo.
РЕЗЮМЕ АСПЕКТОВ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения использовали обратную генетику. Подход с целью рационального ослабления IBV. Этот подход гораздо более управляемый, чем случайное
затухание множественных пассажей в зародышевых яйцах, потому что известно положение каждой мутации и ее влияние
на вирус, то есть причина ослабления, может быть выведена. Ис пользуя свой подход обратной генетики, настоящее
изобретатели идентифицировали различные мутации, вызывающие вирус пониженным уровнем патогенности. Уровни патогенности может быть снижены
таким образом, что когда вирус введенный в эмбрионально е яйцо, он сп особен реплицировать не являясь патогенным для
эмбриона. Такие вирусы могу т быть подходящим для вакцинации in ovo, что является важным преимущество м и
могут име ть улучшение по сравнению с ослабленным IBV vac цинации , полученные после многократного пассажа в зароды шах яйца.
Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает живой аттенуированный коронавирус,
содержащий вариант replicase ген, кодирующий полипротеины, содержащие мутацию в одном или больше неструктурных белков (nsp) -10, nsp -14, nsp -15 или НСП -16.
Вариант гена replicase может кодировать белок com.
использование одно й или нескольких аминокислотных мутаций, выбранных из списока : Pro к Leu в положении 85 SEQ ID NO: 6,
Vai к Leu в положении 393 SEQ ID NO: 7; Leu к He в положении 183 SEQ ID NO: 8;
Vai к He в положении 209 SEQ ID NO: 9.
Ген replicase может кодировать белок, содержащий аминокислотная мутация Pro в Leu в положении 85 SEQ ID НЕТ: 6.
Ген replicase может кодировать белок, содержащий аминокислотные мутации Vai в Leu в положе нии 393 SEQ ID НЕТ: 7;
Leu к He в положении 183 SEQ ID NO: 8; и Вай к He в положении 209 SEQ ID NO: 9.
Ген replicase может кодировать белок, содержащий аминокислотные мутации Pro в Leu в положении 85 SEQ ID

8

НЕТ: 6; Vai к Leu в положении 393 SEQ ID NOU; Лей в Он в положении 183 SEQ ID NO: 8;
и Вай Хэ в позиции 209 из SEQ ID NO: 9.
Ген replicase мож ет содержать один или несколько нуклеотидов. Замены, выбранные из списка:
C к T в положении нуклеотида 12137; От G до C в положении нуклеотида 18114;
Т к А в положении нуклеотида 19047; и G к A в нуклеотидном положении 20139;
по сравнению с последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 1.
Коронавирус может быть вирусом инфекционного бронхита (IBV).
Коронавирус может быть IBV M41. Коронавирус может содержать S -белок, по крайней мере, частично.
из которых относится к серотипу IBV, отличному от M41. Например, субъединица SI или весь белок S может
быть от серотипа IBV, кроме M41. Коронавирус по первому аспекту изобретение имеет
пониженную патогенность п о сравнению с корон авирус,
экспрессирующий соответствующую replicase дикого типа, например при попадании вируса в яйцеклетку с эмбрионом он способен размножаться, не будучи патогенным для
эмбрион а.


Стр.19
США 10 130 701 B2
3
Во втором аспекте настоящее изобретение обеспечивает
вариантный ген replicase , как определено , в связи с первым аспект ом изобретения. В третьем аспекте настоящее изобретение обеспечивает белок
кодируется вариантным геном replicase коронавируса согласно второму аспекту изобретения.
В четвертом аспекте настоящее изобретение обеспечивает
плазмида, содержащая ген replicase по второму аспект у изобретения.
В пятом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ за создание коронавируса по первому аспекту
изобретения , кото рое включает следующие этапы: (i) трансфекция плазмиды согласно четвертому аспекту Изобретения в клетку -хозяин;
(ii) заражение клетки -хозяина рекомбинирующим вирусом
содержащий геном штамма коронавируса с ген replicase ; (привет) обеспечение гомологичной р екомбинации
между последовательностями гена replicase в плазмиде и соответствующие последовательности в рекомбинирующем геном вируса для п олучения модифицированного гена
replicase ; и (iv) отбор для рекомбинации вируса, содержащего
модификацию установленный ген replicase . Рекомбинирующий вирус может быть вирусом осповакцины. Метод также может включать в себя этап:
(v) восстановление рекомбинантного коронавируса,
содержащего модифицированный ген replicase из ДНК из рекомен связывание вируса со стадии (iv).
В шестом аспекте настоящее изобретение обеспечивает ячейку способный вызвать коронавирус согласно первому аспект у
изобретения. В седьмом аспекте настоящее изобретение обеспечивает вакцина, содержащая коронавирус по первому
аспект изобретения и фармацевтическ и приемлемый перевозчик.
В восьмом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ лечения и / или предотвращения заболевания у субъекта который включает этап введения вакцины .
Переходя к седьмому аспекту изобретения к предмету. Дополнительные аспекты изобретения включают:
вакцина согласно седьмому аспекту изобретения для использования при лечении и / или профилактике
заболеваний у субъекта. использование коронавируса в соответствии с первым аспектом изобретение в производстве вакцины для лечения
и / ил и предотвращение заболевания у субъекта. Заболевание может быть инфекционным бронхитом (ИБ).
Способ введения вакцины может быть выбран из группы состоящей из: глазных капель, интраназальное введение,
введение питьевой воды, инъекция после вывода и инъекц ия in ovo. Вакцинация может производиться вакцинацией in ova.
Настоящее изобретение также предлагает способ производства -введение вакцины в соответствии с седьмым
аспектом изобретения вакцины , которая включает в себя этап заражения клетки в соответствии с шестым аспектом изобретения с коронавирусом согласно первому аспекту
изобретения.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
РИСУНОК. 1 - Кинетика роста M41 -R-6 и M41 -R-12 по сравнению с M41 -CK (M41 EP4) на клетках CK РИС. 2 - Клинические признаки, хрипы и хрипы,
ассоциированны е с M41 -R-6 и M41 -R-12 по сравнению с M41 -CK
(M41 EP4) и Beau -R (Бары показывают макет, Beau -R, M41 -R 6, M41 -R 12, M41 -CK EP4 слева направо каждого
момент времени). 4 РИС. 3 - Цилиарная активность вирусов в кольцах трахеи.
выделен из трахеи инфицированных цыплят. 100% активность ресничек указывает на отсутствие влияния вируса; апатогенный,
0% активности указывает на полную потерю активности ресничек, com
полный цилиостаз, указывающий на патогенность вируса (Bars показать макет, Beau -R, M41 -R 6, M41 -R 12, M41 -CK EP4
слева направо от каждого момента времени). РИС. 4 - Клинические признаки, фырканье, связанные с M41R - nsplOrep и M41R -nspl4,15,16rep по сравнению с M41 -R-
12 и M41 -CK (M41 EP5) (планки показывают макет, M41 -R12; M41R -nspl0rep; M41R -nspl4,15,16re p и M41 -CK EP5
слева направо от каждого момента времени). РИС. 5 - Цилиарная активность M41R -nspl0rep и M41R - nspl4,15,16rep по сравнению с M41 -R-12 и M41 -CK в
кольца трахеи, выделенные из трахей, взятых от инфицированных цыплята (Барс показывают макет; M41 -R12;
M41R -nspl0rep;M41R -nspl4,15,16rep и M41 -CK EP5 слева направо каждого момента времени).
РИС. 6 - Клинические признаки, фырканье, связанные с M41R - nsplO, 15rep, M41R -nspl0, 14, 15rep, M41R -nspl0, 14, 16rep, M41R -nspl0, 15, 16rep и M41 -K по сравнению с
M41 -CK (Барс показать макет, M41R -nsplO, 15 репл; M41R - nspl0,14,16rep4; M41R -nsplO, 15,16rep8; М41Р-нсплО , 14,
15repl0; M41 -K6 и M41 -CK EP4 слева направо каждый момент времени).
РИС. 7 - Клинические признаки, хрипы, связанные с M41R - nsplO, 15rep, M41R -nspl0, 14, 15rep, M41R -nspl0, 14, 16rep, M41R -nspl0, 15, 16rep и M41 -K по сравнению с
M41 -CK (Барс показать макет, M41R -nsplO, 15 репл; M14R - nspl0,14,16rep4; M41R -nsplO, 15,16rep8; М41Р-нсплО , 14,
15repl0; M41 -K6 и M41 -CK EP4 слева направо каждый момент времени).
РИС. . 8 - Цилиарная активность M41R -nspl0, 15rep, M41R - nsplO, 14, 15rep, M41R -nspl0, 14, 16rep, M41R -nsplO, 15, 16rep и M41 -K по сравнению с M41 -CK в кольцах трахеи
выделен из трахеи инфицированных цыплят (Bars пока зать макет , M41R -nspl0,15repl; M41R -nsplO, 14,16rep4;
M41R-nsplO , 15,16 rep 8; M41R-nspl 0,14,15 repl 0; M41-K6 и M41 - CK EP4 слева направо от каждой временной точки). РИС. 9 - Кинетика роста rIBV по сравнению с M41 -CK
на клетки СК. РИС. 9A показаны результаты для M41 -R и М41 -К. РИС. 9В показаны результаты для M41 -nspl0 rep;

9

M41R -nspl4, 15, 16 rep; M41R -nspl0, 15 респ ; M41R - нсплО, 15, 16 повт; M41R -nspl0, 14, 15 реп; и M41R -
нсплО, 14, 16. РИС. 10 - Положение аминокислотных мутаций в мутировавшем . Последовательности nsplO, nspl4, nspl5 и
nspl6. РИС. 11— А) Фырканье; Б) Респираторные симптомы (хрип
вместе) и C) Цилиарная активность rIBV M41R -nsp 10,14 rep и rIBV M41R -nsp 10,16 rep com
по сравнению с M41 -CK (столбики показывают макет, M41R - nsplO, 14re p;M41R -nsplO, 16rep и M41 -K слева направо каждого момент времени).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
В настоящем изобретении предлагается коронавирус, содержащий:
вариантный ген replicase , который при экспрессии в коронавирус, снижает патогенность вируса
по сравнению с соответствующим коронавирусом, который
включает ген replicase дикого типа. Коронавирус Гаммакоронавирус - это вирус животного
происхождения, принадлежащий к семейству Coronaviridae. Коронавирусы окутаны
вирусы с геномом одноцепочечной РНК с положительным смыслом и спиральная симметрия.

Replicase -это
фермент , катализирующий точное воспроизводство
копии с матрицы (ДНК или РНК ). Термин применяе
тся исключительно в отношении фермента , реплиц
ирующего определенные геномы РНК вирусов (см .
РНК -зависимая РНК -полимераза ).

Стр.20
США 10 130 701 B2 5 Размер генома коронавирусов колеблется от прибл. от 27 до 32 килобаз, что является самым длинным размером для любого известного РНК -вирус а.
Коронавирусы в первую очередь поражают верхние дыхательные пути или желудочно -кишечный тракт
млекопитающих и птиц. 5:55 различные известные в настоящее время штаммы коронавирусов заражают
люди. Самый известный человеческий коронавирус, SARS - CoV, вызывающий тяжелый острый респираторный синдром (SARS), имеет уникальный пато генез, потому что вызывает 2
инфекции верхних и нижних дыхательных путей, а также могут вызвать гастроэнтерит. Ближневосточный
респираторный синдром коронавирус (БВРС -КоВ) также вызывает нарушение дыхательных путей ,инфекция тракта у
человека. Коронавирусы, как полагают,вызывают значительный процент всех распространенных простуд у человека , взрослых людей .
Коронавирусы также вызывают ряд заболеваний у домашнего скота. Животные и домашние животные, некоторые из
которых могут быть серьезны и представляют угрозу для сельскохозяйственной отрасли. Economi
К значимым коронавирусам сельскохозяйственных животных относятся:вирус инфекционного бронхита (IBV), который в основном вызывает дыхательные раторное заболевание
цыплят и серьезно влияет на домашнюю птицу и промыш ленность по всему миру; коронавирус свиней
(передаваемый газтроэнтерит, TGE) и коронавирус крупного рогатого скота, которые оба вызывают диарею у молодня ка. У кошачьего коронавируса две
формы, кишечный коронавирус кошек - возбудитель второстепенных . Клиническое значение, но спонтанная
мутация этого вируса может привести к кошачьему инфекционному перитониту (FIP), заболеванию
связано с высокой смертностью. Также существует два типа собачьего коронавируса (CCoV),
тот, который вызывает легкое желудочно -кишечное заболевание, и тот, который как было установлено, вызывает
респираторное заболевание. Гепатит мыши вирус (MHV) - это коронавирус, вызывающий эпидемию . М ышиная болезнь с высокой смертностью,
особенно среди лабораторных мышей. Коронавирусы делятся на четыре группы, как показано ниже:
Альфа
Коронавирус собак (CCoV)
Коронавирус кошек (FeCoV) Коронавирус человека 229E (HCoV -229E)
Вирус эпидемической диареи свиней (PEDV) Вирус трансмиссивного гастроэнтерита (TGEV) Коронавирус человека NL63 (Нидерланды или Нью -Хейвен)
Бета Коронавирус крупного рогатого скота (BCoV)
Респираторный коронавирус собак (CRCoV) - часто в Юго -Восточной Азии и Микронезии Коронавирус человека OC43 (HCoV -OC43)
Вирус гепатита мышей (MHV) Вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита сви ней(HEV)
Коронавирус Крысы (Рой). Крысиный коронавирус довольно распространен ссужено в Восточной Австралии, где по
состоянию на март / апрель 2008 г. найден среди местных и одичавших колоний грызунов. (Пока нет общепринятого названия) (HCoV -HKUl)
Коронави рус тяжелого острого респираторного синдрома (SARS -CoV)
Коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (MERS -CoV)
ГаммаВирус инфекционного бронхита (IBV) Коронавирус Турции (вирус болезни Блюкомб) Коронавирус фазана
Коронавирус цесарок
6
Дельта
Коронавирус Бюльбюля (BuCoV)
Коронавирус молочницы (ThCoV) Коронавирус Мунии (MuCoV)
Коронавирус свиней (PorCov) HKU15 Вариант гена репликазы коронавируса настоящее
изобретение может быть получено из альфа -коронавируса такие как TGEV; бета -коронавирус, так ой как MHV; или гаммакоронавирус, такой как IBV.
Используемый здесь термин «полученный из» означает, что ген репликазы содержит по существу тот же нуклеотид
последовательность в качестве гена репликазы дикого типа соответствующего коронавирус а. Например, в ариантный ген
репликазы настоящее изобретение может иметь до 80%, 85%, 90%, 95%,98% или 99% идентичности с последовательностью репликазы дикого типа.
Вариантный ген репликазы коронавируса кодирует белок содержащий мутацию в одном или нескольких
неструктурн ых белок (nsp) -10, nsp -14, nsp -15 или nsp -16 при сравнении к последовательности дикого типа неструктурного белка.
IBV Птичий инфекционный бронхит (ИБ) протекает остро и
сильно заразное респираторное заболевание кур, вызывающее
значительные экономические п отери. Заболевание характеризуется: респираторные симптомы, включая удушье, кашель, чихание,
хрипы в трахее и выделения из носа. У молодых цыплят может возникнуть тяжелая респираторная
недостаточность. Послойно, респираторный дистресс, нефрит, снижение яйц еноскости и потеря
внутреннее качество яйца и качество яичной скорлупы являются общими. У бройлеров кашель и хрипы являются обычными
клиническими проявлениями. Признаки, быстро распространяющиеся по всем птицам
помещения.

10

Заболеваемость у невакцинированног о стада 100%. Смертность var
в зависимости от возраста, штамма вируса и вторичных инфекций , но может достигать 60% в невакцинированных стадах.
Первым идентифицированным серотипом ИБК был штат Массачусетс,
но в США несколько серотипов, в том числе Аркан sas и Delaware, в настоящее время распространяются в
дополнение первоначально идентифицировал тип Массачусетса. Штамм IBV Beaudette был получен как минимум после
150 пассажей в куриных эмбрионах. IBV Beaudette больше не патогенен для вылупившихся цыплят, но быстро убивает
эмбрионы. H120 - коммерч еский живой аттенуированный IBV Massachusetts вакцинный штамм серотипа, ослабленный
примерно на 120ход ов в куриных яйцах с эмбрионами. H52 другой
Массачусетская вакцина представляет собой более раннюю и слегка бол ее патогенный пассаж вируса (пассаж 52) во время
развитие H120. Вакцины на основе H120 распространены. моно используется. IB QX - это вирулентный полевой изолят IBV. Иногда бывает
известный как «Китайский QX», поскольку изначально был изолирован . Снижение вспышек заболеваний в районе
Циндао в Китае в середине 1990 -х гг. С тех пор вирус подкрался к Европе . С 2004 года возникли серьезные
проблемы с яйценоскостью. Идентифицирован с очень похожим вирусом в некоторых частях Западной Европы , преимущественно в Нид ерландах,
но также сообщалось из Германии, Франции, Бельгии, Дании и Великобритании.
Вирус, выделен ный из голландских случаев, был идентифицирован Голландским научно -исследовательским институт ом в Девентере как новый штамм,
они назвали D388. Китайская св язь пришла из меха тесты, которые показали, что вирус на 99% похож на
Китайские вирусы QX. Живая аттенуированная вакцина против ИБК, подобная QX
штамм в настоящее время разработан. IBV - это вирус в оболочке, который размножается в клетке. цитоплазма и сод ержит несегментированный,
одноцепочечный, геном положительной смысловой РНК. IBV имеет РНК размером 27,6 т.п.н. геном и, как и все
коронавирусы, содержит четыре структуры структурные белки; шип гликопротеина (S), малая мембрана
pro

Стр.21
США 10 130 701 B2
7 теин (E), интегральный мембранный белок (M) и нуклеокапсид
белок (N), который взаимодействует с геномной РНК. Геном устроен следующим образом:
5'UTR - ген полимеразы (репликазы) - структурный белок гены (SEMN) --UTR 3 '; где UTR не переведены обла сти (каждая -500 нуклеотидов в IBV).
Липидная оболочка содержит три мембранных белка: S, M и E. Белок S IBV представляет собой гликопротеин I типа,
который олигомеризуется в эндоплазматическом ретикулуме и
собирается в гомотример, вставленный в мембрану ви риона через трансмембранный домен и связан через неко -
валентные взаимодействия с белком М. После включения рацион на частицы коронавируса, белок S отвечает
для связывания с рецептором клетки -мишени и слияния вирусного
и клеточные мембраны. Гликопротеин S состоит из четырех домены: сигнальная последовательность, которая расщепляется во время синтеза;
эктодомен, который присутствует снаружи вириона
частица; трансмембранная область, отвечающая за якорь введение белка S в липидный бислой частицы вириона;
и цитоплазматический хвост. Все коронавирусы также кодируют набор дополнительных белков.
гены неизвестной функции, которые не требуются для ответа катион in vitro, но может играть роль в патогенезе. IBV
8 кодирует два дополнительных гена, гены 3 и 5, которые оба экспрессируют два дополнительных белка 3a, 3b и 5a, 5b
соответственно тивительно.
Вариант гена репликазы коронавируса настоящее изобретение может быть получено из IBV. Например
IBV может быть IBV Beaudette, H120, H52, IB QX, D388 или M41.
IBV может бы ть IBV M41. M41 - прототип Massa серотипа chusetts, выделенного в США в 1941 году. изолят, используемый во многих лабораториях по всему миру
в качестве патогенная лабораторная окраска и может быть получена в
АТСС (VR - 21 ™). Аттенуированные варианты также используются в
нескольких вакцинах. производителей вакцин против ИБК против серотипов Массачусетса
вызывая проблемы в поле. Авторы настоящего изобретения решили
использовать этот штамм, так как они много лет работали над этим
15 вируса, и потому что послед овательность полного вируса геном имеется. Изолят M41, M41 -CK, используемый авторы настоящего изобретения были адаптированы для
выращивания первичных цыплят клетки почек (СК) и поэтому считались пригодными для
восстановление как инфекционного вируса из кДН К полного 20 геном. Это представитель патогенного ИБК и
fore может быть проанализирован на предмет мутаций, которые вызывают потерю или снижение патогенности.
Последовательность генома IBV M41 -CK представлена как SEQ ID NO: 1.
Последовательность IBV M41 -CK SEQ ID NO: 1
ACTTAAGATAGATATTAATATATATCTATCACACTAGCCTTGCGCTAGATTTCCAACTTA
ACAAAACGGACTTAAATACCTACAGCTGGTCCTCATAGGTGTTCCATTGCAGTGCACTTT
AGTGCCCTGGATGGCACCTGGCCACCTGTCAGGTTTTTGTTATTAAAATCTTATTGTTGC TGGTATCACTGCTTGTTTTGCCGTGTCTCACTTTATACATCCG
TTGCTTGGGC TACCTAG TATCCAGCGTCCTACGGGCGCCGTGGCTGGTTCGAGTGCGA
AGAACCTCTGGTTCATCTA GCGGTAGGCGGGTGTGTGGAAGTAGCACTTCAGACGTACC
GGTTCTGTTGTGTGAAATAC GGGGTCACCTCCCCCCACATACCTCTAAGGGCTTTTGAGCCTAGCGTTGGGCTACGTTCT
CGCATAAGGTCGGCTATACGACGTTTGTAGGGGGTAGTGCCAAACAACCCCTGAGGTGAC
AGGT TCTGGTGGTGTTTAGTGAGCAGACATACAATAGACAG TGACAACATGGCTTCAAGC
CTAAAACAGGGAGTATCTGCGAAACTAAGGGATGTCATTGTTGTATCCAAAGAGATTGCT GAACAACTTTGTGACGCTTTGTTTTTCTATACGTCACACAAC
CCTAAGGATTACGCTGAT GCTTTTGCAGTTAGGCAGAAGTTTGATCGTAATCTGCAGAC
TGGGAAACAGTTCAAATTT GAAACTGTGTGTGGTC TCTTCCTCTTGAAGGGAGTTGACAA AATAACACCTGGCGTCCCA
GCAAAAGTCTTAAAAGCCACTTCTAAGTTGGCAGATTTAGAAGACATCTTTGGTGTCTCT

11

CCCTTTGCAAGAAAATATCGTGAACTTTTGAAGACAGCATGCCAGTGGTCTCTTACTGTA
GAAACACTGGATGCTCGTGCACAAACTCTTGATGAAATTTTTGACCCTACTGAAATACTT TGGCTTCAGGTGGCAGCAAAAATCCAAG TTTCGGCTATGGC
GATGCGCAGGCTTGTTGGA GAAGTAACTGCAAAAGTCATGGATGCTTTGGGCTCAAATAT
GAGTGCTCTTTTCCAGATT TTTAAACAACAAATAGTCAGAATTTTTCAAAAAGCGCTGGC
TATTTTTGAGAATGTGAGT GAATTACCACAGCGTATTGCAGCACTTAAGATGGCTTTTGCTAAGTGTGCCAAGTCCATT
ACTGTTGTGGTTATGGAGAGGACTCTAGTTGTTAGAGAGT T CGCAGGAACTTGTCTTGCA
AGCATTAATGGTGCTGTTGCAAAATTCTTTGAAGAACTCCCAAATGGTTTCATGGGTGCT AAAATTTTCACTACACTTGCCTTCTTTAGGGAGGCTGCAGTG
AAAATTGTGGATAACATA CCAAATGCACCGAGAGGCACTAAAGGGTTTGAAGTCGTTG
GTAATGCCAAAGGTACACAA

Стр. 22
США 10 130 701 B2 10 9 - продолжение
GTTGTTGTGCGTGGCATGGGAAATGACTTAACACTGGTTGAGCAAAAAGCTGAAATTGCT
GTGGAGTCAGAAGGTTGGTCTGCAATTTTGGGTGGACATCTTTGCTATGTCTTTAAGAGT GGTGATCGCTTTTACGCGGCACCTCTTTCAGGAAATTTTGCA
TTGCATGATGTGCATTGT TGTGAGCGTGTTGTCTGTCTTTCTGATGGTGTAACACCGGAG
ATAAATGATGGACTTATT CTTGCAGCAATC TACTCTTCTTTTAGTGTCGCAGAACTTGTG
GCAGCCATTAAAAGGGGT GAACCATTTAAGTTTCTGGGTCATAAATTTGTGTATGCAAAGGATGCAGCAGTTTCTTTT
ACATTAGCGAAGGCTGCTACTATTGCAGATGTTTTGAAGCTGTTTCAATCAGCGCGTGTG
AAAGTAGAAGATGTTTGGTCTTCACTTACTGAAAAGTCTTTTGAATTCTGGAGGCTTGCA TATGGAAAAGTGCGTAATCTCGAA GAATTTGTTAAGACTTG
TTTTTGTAAGGCTCAAATG GCGATTGTGATTTTAGCGACAGTGCTTGGAGAGGGCATTTG
GCATCTTGTTTCGCAAGTC ATCTATAAAGTAGGTGGTCTTTTTACTAAAGTTGTTGACTTT
TGTGAAAAATATTGGAAA GGTTTTTGTGCACAGTTGAAAAGAGCTAAGCTCATTGTCACTGAAACCCTCTGTGTTTTG
AAAGGAGTTGCACAGCATTGTTTTCAACTATTGCTGGATGCAATACAGTTTATGTATAAA
AGTTTTAAGAAGTGTGCACTTGGTAGAATCCATGGAGACTTGCTCTTCTGGAAAGGAGGT
GTGCACAAAATTATTCAAGAGGGCGATGAAATTTGGTTTGAGGGCATTGATAGTATTGAT GTTGAAGATCTGGGTGTTGTTCAAGAAAAATTGATTGATTTT
GATGTTTGTGATAATGTG ACACTTCCAGAG AACCAACCCGGTCATATGGTTCAAATCGA
GGATGACGGAAAGAACTAC ATGTTCTTCCGCTTCAAAAAGGATGAGAACATTTATTATAC
ACCAATGTCACAGCTTGGT GCTATTAATGTGGTTTGCAAAGCAGGCGGTAAAACTGTCACCTTTGGAGAAACTACTGTG
CAAGAAATACCACCACCTGATGTTGTGTTTATTAAGGTTAGCATTGAGTGTTGTGGTGAA
CCATGGAATACAATCTTCAAAAAG GCTTATAAGGAGCCCA TTGAAGTAGAGACAGACCTC ACAGTTGAACAATTGCTCTCTGTGGTCTATGAGAAAATGTG
TGATGATCTCAAGCTGTTT CCGGAGGCTCCAGAACCACCACCATTTGAGAATGTCACACT
TGTTGATAAGAATGGTAAA GATTTGGATTGCATAAAATCATGCCATCTGATCTATCGTGAT
TATGAGAGCGATGATGAC
ATCGAGGAAGAAGATGCAGAAGAATGTGACACGGAT TCAG GTGATGCTGAGGAGTGTGAC
ACTAATTCAGAATGTGAAGAAGAAGATGAGGATACTAAAGTGTTGGCTCTTATACAAGAC CCGGCAAGTAACAAATATCCTCTGCCTCTTGATGATGATTA
TAGCGTCTACAATGGATGT ATTGTTCATAAGGACGCTCTCGATGTTGTGAATTTACCATCT
GGTGAAGAAACCTTTGTT GTCAATAACTGCTTTGAAGGGGCTGTTAAAGCTCTTCCGCA
GAAAGTT ATTGATGTTCTA GGTGACTGGGGTGAGGCTGTTGATGCGCAAGAACAATTGTGTCAACAAGAATCAACTCGG
GTCATATCTGAGAAATCAGTTGAGGGTTTTACTGGTAGTTGTGATGCAATGGCTGAACAA
GCTATTGTTGAAGAGCAGGAAATAGTACCTGTTGTTGAACAAAGTCAGGATGTAGTTGTT TTTACACCTGCAGACCTAGAAGTTGTTAAAGAAACAGCAG
AAGAGGTTGATGAGTTTATT CTCATTTCTGCTGTCCCTAAAGAAGAAGTTGTGTCTCAGGA
GAAAGAGGAGCCACAGGTT GAGCAAGAGCCTACCCTAGTTGTTAAAGCACAACGTGAGA
AGAAGGCTAAAAAGTTCAAA GTTAAACCAGCTACATGTGAAAAACCCAAATTTTTGGAGTACAAAACATGTGTGGGTGAT
TTGGCTGTTGTAATTGCCAAAGCATTGGATGAGTTTAAAGAGTTCTGCATTGTAAACGCT
GCAAATGAGCA CATGTCGCATGGTGGTGGCGTTGCAAAGG CAATTGCAGACTTTTGTGGA
CCGGACTTTGTTGAATATTGCGCGGACTATGTTAAGAAACATGGTCCACAGCAAAAACTT GTCACACCTTCATTTGTTAAAGGCATTCAATGTGTGAATAAT
GTTGTAGGACCTCGCCAT GGAGACAGCAACTTGCGTGAGAAGCTTGTTGCTGCTTACAA
GAGTGTTCTTGTAGGTGGA

Стр. 23
США 10 130 701 B2
11 - продолжение GTGGTTAACTATGTTGTGCCAGTTCTCTCATCAGGGATTTTT
GGTGTAGATTTTAAAATA TCAATAGATGCTATGCGCGAAGCTTTTAAAGGTTGTGCCAT
ACGCGTTCTTTTATTTTCT CTGAGTCAAGAACACATCGATTATTTCGATGCAACTTGTAA
GCAGAAGACAATTTATCTT ACGGAGGATGGTGTTAAATACCGCTCTGTTGTTTTAAAACCTGGTGATT CTTTGGGTCAA
TTTGGACAGGTTTTTGCAAGAAATAAGGTAGTCTTTTCGGCTGATGATGTTGAGGATAAA
GAAATCCTCTTTATACCCACAACTGACAAGACTATTCTTGAATATTATGGTTTAGATGCG
CAAAAGTATGTAACATATTTGCAAACGCTTGCGCAGARATGGGATGTTCAATATAGAGAC AATTTTGTTATATTAGAGTGGCGTGACGGAAATTGCTGGATT
AGTTCAGCAATAGTTCTC CTTCAAGCTGCTAAAATTAGATTTAAAGGTTTTCTTGCAGA
AGCATGGGCTAAACTGTTG GGTGGAGATCCTACAGACTTTGTTGCCTGGTGTTATGCAAGTTGCAATGCTAAAGTAGGT
GATTTTTCAGATGCTAATTGGCTTTTGGCCAATTTAGCAGAACATTTTGACGCAGATTAC
ACAAATGCACTTCTTAAGAAGTGTGTGTCGTGCAATTGTGGTGTTAAGAGTTATGAACTT
AGGGGTCTTGAAGCCTGTATTCAGCCAGTTCGAGCACCTAATCTTCTACATTTTAAAACG CAATATTCAAATTGCCCAACCTGTGGTGCAAGTAGTACGGA
TGAAGTAATAGAAGCTTCA TTACCGTACTTATTGCTTTTTGCTACTGATGGTCCTGCTACAG
TTGATTGTGATGAAAAT GCTGTAGGGACTGTTGTTTTCATTGGCTCTACTAATAGTGGC
CATTGTTATACACAAGCC GATGGTAAGGCT TTTGACAATCTTGCTAAGGATAGAAAATT TGGAAGGAAGTCGCCTTAC

12

ATTACAGCAATGTATACACGTTTTTCTCTTAGGAGTGAAAATCCCCTACTTGTTGTTGAA
CATAGTAAGGGTAAAGCTAAAGTAGTAAAAGAAGATGTTTCTAACCTTGCTACTAGTTCT AAAGCCAGTTTTGACGATCTTACTGACTTTGAACACTGGTA
TGATAGCAACATCTATGAG AGTCTTAAAGTGCAGGAGACACCT GATAATCTTGATGAATA
TGTGTCATTTACGACAAAG GAAGATTCTAAGTTGCCACTGACACTTAAAGTTAGAGGTAT
CAAATCAGTTGTTGACTTT AGGTCTAAGGATGGTTTTACTTATAAGTTAACACCTGATACTGATGAAAATTCAAAAACA
CCAGTCTACTACCCAGTCTTGGATTCTATTAGTCTTAGGGCAATATGGGTTGAAGGCAGT
GCTAATTTTGTTGTTGGGCATCCAAATTATTATAGT AAGTCT CTCCGAATTCCCACGTTT TGGGAAAATGCCGAGAGCTTTGTTAAAATGGGTTATAAAAT
TGATGGTGTAACTATGGGC CTTTGGCGTGCAGAACACCTTAATAAACCTAATTTTGGAGA
GAATTTTTAACATTGCTAAG AAAGCTATTGTTGGATCTAGTGTTGTTACTACGCAGTGTGGT
AAAATACTAGTTAAAGCA GCTACATACGTTGCCGATAAAGTAGGTGATGGTGTAGTTCGCAATAT TACAGATAGAATT
AAGGGTCTTTGTGGATTCACACGTGGCCATTTTTGAAAAGAAAATGTCCCTACAATTTCTA
AAGACACTTGTGTTCTTTTTCTTTATTTCTTAAAGGCTAGTGCTAAGAGTTTAGTTTCT
AGCTATAAGATTGTGTTATGTAAGGTGGTGTTTGCTACCTTACTTATAGTGTGGTTTATA TACACAAGTAATCCAGTAGTGTTTACTGGAATACGTGTGCT
AGACTTCCTATTTGAAGG T TCTTTATGTGGTCCTTATAATGACTACGGTAAAGATTCTTTT
GATGTGTTACGGTATTGT GCAGGTGATTTTACTTGTCGTGTGTGTTTACATGATAGAGATTCACTTCATCTGTACAAA
CATGCTTATAGCGTAGAACAAATTTATAAGGATGCAGCTTCTGGCATTAACTTTAATTGG
AATTGGCTTTATTTGGTCTTTCTAATATTATTTGTTAAGCCAGTGGCAGGTTTTGTTATT
ATTTGTTATT GTGTTAAGTATTTGGTATTGAGTTCAACTGTGT TGCAAACTGGTGTAGGT TTTCTAGATTGGTTTGTAAAAACAGTTTTTACCCATTTTAATT
TTATGGGAGCGGGATTT 12 TATTTCTGGCTCTTTTACAAGATATACGTACAAGTGCATCAT
ATATTGTACTGTAAGGAT

Стр. 24
США 10 130 701 B2 13 - продолжение
GTAACATGTGAAGTGTGCAAGAGAGTTGCACGCAGCAACAGGCAAGAGGTTAGCGTTGTA
GTTGGTGGACGCAAGCAAATAGTGCATGTTTACACTAATTCTGGCTATAACTTTTGTAAG AGACATAATTGGTATTGTAGAAATTGTGATGATTATGGTCA
CCAAAATACATTTATGTCC CCTGAAGTTGCTGGCGAGCTTTCTGAAAAGCTTAAGCGCCA
TGTTAAACCTACAGCATAT GCTTACCACGTT GTGTATGAGGCATGCGTGGTTGATGATTTT
GTTAATTTAAAATATAAG GCTGCAATTGCTGGTAAGGATAATGCATCTTCTGCTGTTAAGTGTTTCAGTGTTACAGAT
TTTTTAAAGAAAGCTGTTTTTCTTAAGGAGGCATTGAAATGTGAACAAATATCTAATGAT
GGTTTTATAGTGTGTAATACACAGAGTGCGCATGCACTAGAGGAAGCAAAGAATGCAGCC GTCTATTATGCGCAATATCTGTGT AAGCCAATACTTATACTT
GACCAGGCACTTTATGAG CAATTAATAGTAGAGCCTGTGTCTAAGAGTGTTATAGATAA
AGTGTGTAGCATTTTGTCT AATATAATATCTGTAGATACTGCAGCTTTAAATTATAAGGC
AGGCACACTTCGTGATGCT
CTGCTTTCTATTACTAAAGACGAAGAAGCCGTAGATATGGCTATCTTCTGCCACAATCAT
GAAGTGGAATACACTGGTGACGGTTTTACTAATGTGATACCGTCATATGGTATGGACACT GATAAGTTGACACCTCGTGATAGAGGGTTTTTGATAAATGC
AGATGCTTCTATTGCTAAT TTAAGAGTCAAAAATGCTCCTCCGGTAGTATGGAAGTTTTC
TGATCTTATTAAATTGTCT GACAGTTGCCTTAAATATTTAATTTCAGCTACTGTCAAGTCA
GGAGGTCGTTTCTTTATA ACAAAGTCTGGT GCTAAACAAGTTATTTCTTGTCATACCCA GAAACTGTTGGTAGAGAAA
AAGGCAGGTGGTGTTATTAATAACACTTTTAAATGGTTTATGAGTTGTTTTAAATGGCTT
TTTGTCTTTTATATACTTTTTACAGCATGTTGTTTGGGTTACTACTATATGGAGATGAAT AAAAGTTTTGTTCACCCCATGTATGATGTAAACTCCACACT
GCATGTTGAAGGGTTCAAA GTTATAGACAAAGGTGTTATTAGA GAGATTGTGTCAGAAGA
TAATTGTTTCTCTAATAAG TTTGTTAATTTTGACGCCTTTTGGGGTAAATCATATGAAAAT
AATAAAAACTGTCCAATT GTTACAGTTGTTATAGATGGTGACGGGACAGTAGCTGTTGGTGTTCCTGGTTTTGTATCA
TGGGTTATGGATGGTGTTATGTTTGTGCATATGACACAGACTGATCGTAGACCTTGGTAC
ATTCCTACCTGGTTTAATAGAGAAATTGTTGGTTAC ACTCAG GATTCAATTATCACTGAG
GGTAGTTTTTATACATCTATAGCATTATTTTCTGCTAGATGTTTATATTTAACAGCCAGC AATACACCTCAATTGTATTGTTTTAATGGCGACAATGATGC
ACCTGGAGCCTTACCATTT GGTAGTATTATTCCTCATAGAGTATACTTCCAACCTAATGGT
GTTAGGCTTATAGTTCCA CAACAAATACTGCATACACCCTACATAGTGAAGTTTGTTTCAGACAGC TATTGTAGAGGT
AGTGTATGTGAGTATACTAAACCAGGTTACTGTGTGTCACTAGACTCCCAATGGGTTTTG
TTTAATGATGAATACATTAGTAAACCTGGCGTTTTCTGTGGTTCTACTGTTAGAGAACTT
ATGTTTAATATGGTTAGTACATTCTTTACTGGTGTCAACCCTAATATTTATATTCAGCTA GCAACTATGTTTTTAATACTAGTTGTTATTGTGTTAATTTTTG
CAATGGTTATAAAGTTT CAAGGTGTTTTTAAAGCTTATGCGACCATTGTGTTTACAATA
ATGTTAGTTTGGGTTATT AATGCATTTGTTTTGTGTGTACATAGTTATAATAGTGTTTTA
GCTGTTATATTATTAGTA CTCTATTGCTATGCATCATTGGTTACAAGTCGCAATACTGCTATAATAATGCATTGTTGG
CTTGTTTTTACCTTTGGTTTAATAGTACCCACATGGTTGGCTTGTTGCTATCTGGGATTT
ATTCTTTATAT GTACACACCGTTGGTTTTCTGGTGTTACGGT ACTACTAAAAATACTCGT
AAGTTGTATGATGGCAACGAGTTTGTTGGTAATTATGACCTTGCTGCGAAGAGCACTTTT GTTATTCGTGGTACTGAATTTGTTAAGCTTACGAATGAGATA
GGTGATAAATTTGAAGCC 14 TATCTTTCTGCGTATGCTAGACTTAAATACTATTCAGGCACT
GGTAGTGAGCAAGATTAC

Стр.25
США 10 130 701 B2 16 15 - продолжение
TTGCAAGCTTGTCGTGCATGGTTAGCTTATGCTTTGGACCAATATAGAAATAGTGGTGTT
GAGGTTGTTTATACCCCACCGCGTTACTCTATTGGTGTTAGTAGACTACACGCTGGTTTT
AAAAAACTAGTTTCTCCTAGTAGTGCTGTTGAGAAGTGCATTGTTAGTGTCTCTTATAGA

13

GGCAATAATCTTAATGGACTGTGGCTGGGTGATTCTATTTACTGC CCACGCCATGTGTTA
GGTAAGTTTAGTGGTGACCAGTGGGGTGACGTACTAAACCTTGCTAATAATCATGAGTTT GAAGTTGTAACTCAAAATGGTGTTACTTTGAATGTTGTCAG
CAGGCGGCTTAAAGGAGCA GTTTTAATTTTACAAACTGCAGTTGCCAATGCTGAAACTCCT
AAGTATAAGTTTGTTAAA GCTAATTGTGGTGATAGTTTCACTATAGCTTGTTCTTATGGT
GGTACAGTTATAGGA CTT TACCCTGTCACTATGCGTTCTAATGGTACTATTAGAGCATCTTTCCTAGCAGGAGCCTGT
GGCTCAGTTGGTTTTAATATAGAAAAGGGTGTAGTTAATTTCTTTTATATGCACCATCTT
GAGTTACCTAATGCATTACACACTGGAACTGACCTAATGGGTGAGTTTTATGGTGGTTAT GTAGATGAAGAGGTTGCGCAAAGAGTGCCACCAGATAATC
TAGTTACTAACAATATTGTA GCATGGCTCTATGGGGCAATTATTAGTGTTAAAGAAAGTAG
TTTTTCACAACCTAAATGG TTGGAGAGTACTACTGTTTCTATTGAAGATTACAATAGGTG
GGCTAGTGATAATGGTTTT ACTCCATTTTCCACTAGTACTGCTATTACTAAATTAAGTGCTATAACTGGGGTTGATGTT
TGTAAACTCCTTCGCACTATTATGGTAAAAAGTGCTCAATGGGGTAGTGATCCCATTTTA
GGACAATATAAT TTTGAAGACGAATTGACACCAGAATCTGT ATTTAATCAAGTTGGTGGT
GTTAGGTTACAGTCTTCTTTTGTAAGAAAAGCTACATCTTGGTTTTGGAGTAGATGTGTA TTAGCTTGCTTCTTGTTTGTGTTGTGTGCTATTGTCTTATTTAC
GGCAGTGCCACTTAAG TTTTATGTACATGCAGCTGTTATTTTGTTGATGGCTGTGCTCT
TTATTTCTTTTACTGTT AAACATGTTATGGCATACATGGAC ACTTTCCTATTGCCTAC ATTGATTACAGTTATTATT
GGAGTTTGTGCTGAAGTCCCTTTCATATACAATACTCTAATTAGTCAAGTTGTTATTTTC
TTAAGCCAATGGTATGATCCTGTAGTCTTTGATACTATGGTACCATGGATGTTATTGCCA
TTAGTGTTGTACACTGCTTTTAAGTGTGTACAAGGCTGCTATATGAATTCTTTCAATACT TCTTTGTTAATGCTGTATCAGTTTATGAAGTTAGGT TTTGTTA
TTTACACCTCTTGAAAC ACTCTTACTGCATATACAGAAGGTAATTGGGAGTTATTCTTT
GAGTTGGTTCACACTATT GTGTTGGCTAATGTTAGTAGTAATTCCTTAATTGGTTTAATT
GTTTTTAAGTGTGCTAAG TGGATTTTATATTATTGCAATGCAACATACTTTAATAATTATGTGTTAATGGCAGTCATG
GTTAATGGCATAGGCTGGCTTTGCACCTGTTACTTTGGATTGTATTGG TGGGTTAATAAA
GTTTTTGGTTTAACCTTAGGTAAATACAATTTTAAAGTTTCAGTAGATCAATATAGGTAT
ATGTGTTTGCATAAGGTAAATCCACCTAAAACTGTGTGGGAGGTCTTTACTACAAATATA CTTATACAAGGAATTGGAGGCGATCGTGTGTTGCCTATAGC
TACAGTGCAATCTAAATTG AGTGATGTAAAGTGTACAACTGTTGTTTTAATGCAGCTTTTG
ACTAAGCTTAATGTTGAA GCAAATTCAAAAATGCATGCTTATCTTGTTGAGTTACACAATAAAATCCTCGCATCTGAT
GATGTTGGAGAGTGCATGGATAATTTATTGGGTATGCTTATAACACTATTTTGTATAGAT
TCTACTATTGATTTGGGTGAGTATTGTGATGATATACTTAAGAGGTCAACTGTATTACAA
TCGGTTACTCAAGAGTTTTCGCACATACCCTCGTATGCTGAATATGAAAGAGCTAAGAGT ATTTATGAAAAGGTTTTAGCCGATTCTAAAAATGGTGGTGT
AACACAGCAAGAGCTTGCT GCATATCGTAAAGCTGCCAATATTGCAAAGTCAGTTTTTGA
TAGAGACTTGGCTGTTCAA AAGAAGTTAGATAGCATGGCAGAACGTGCTATGACAACAA
TGTATAAAGAGGCGCGTGTA

Стр. 26
США 10 130 701 B2 17 - продолжение ACTGATAGAAGAGCAAAATTAGTTTCATCATTACATGCACT
ACTTTTTTCAATGCTTAAG AAAATAGATTCTGAGAAGCTTAATGTCTTATTTGACCAGGCGAATAGTGGTGTTGTACCC
CTAGCAACTGTTCCAATTGTTTGTAGTAATAAGCTTACCCTTGTTATACCAGACCCAGAG
ACGTGGGTCAAGTGTGTGGAGGGTGTGCATGTTACATATTCAACAGTTGTTTGGAATATA GACTGTGTTACT GATGCCGATGGCACAGAGTTACACCCCAC
TTCTACAGGTAGTGGATTG ACTTACTGTATAAGTGGTGATAATATAGCATGGCCTTTAAA
GGTTAACTTGACTAGGAAT GGGCATAATAAGGTTGATGTTGCCTTGCAAAATAATGAGCT
TATGCCTCACGGTGTAAAG ACAAAGGCTTGCGTAGCAGGTGTAGATCAAGCACATTGTAGCGTTGAGTCTAAATGTTAT
TATACAAGTATTAGTGGCAGTTCA GTTGTAGCTGCTATTACC TCTTCAAATCCTAATCTG
AAAGTAGCCTCTTTTTTGAATGAGGCAGGTAATCAGATTTATGTAGACTTAGACCGAGCA
TGTAAATTTGGTATGAAAGTGGGTGATAAGGTTGAAGTTGTTTACCTGTATTTTATAAAA AATACGAGGTCTATTGTAAGAGGTATGGTACTTGGTGCTAT
ATCTAATGTTGTTGTGTTA CAATCTAAAGGTCATGAGACAGAGGAAGTGGATGCTGTAG
GCATTCTCTCACTTTGTTCT TTTGCAGTAGATCCTGCGGATACATATTGTAAATATGTGGC
AGCAGGTAATCAACCTTTA GGTAACTGTGTTAAAATGTTGACAGTACATAATGGTAGTGGTTTTGCAATAACATCAAAG
CCAAGTCCAACTCCGGATCAGGATTCTTATGGAGGAGCTTCTGTGTGTCTTTATTGTAGA
GCACATATAGCA CACCCTGGCGGAGCAGGAAATTTAGATG GACGCTGTCAATTTAAAGGT TCTTTTGTGCAAATACCTACTACGGAGAAAGATCCTGTTGG
ATTCTGTCTACGTAACAAG GTTTGCACTGTTTGTCAGTGTTGGATTGGTTATGGATGTCAG
TGTGATTCACTTAGACAA CCTAAACCTTCTGTTCAGTCAGTTGCTGTTGCATCTGGTTTTG
ATAAGAATTATTTAAAC GGGTACGGGGTAGCAGTGAGGCTC GGCTGATACCCCTAGCT AATGGATGTGACCCCGATG
TTGTAAAGCGAGCCTTTGATGTTTGTAATAAGGAATCAGCCGGTATGTTTCAAAATTTGA
AGCGTAACTGTGCACGATTCCAAGAAGTACGTGATACTGAAGATGGAAATCTTGAGTATT
GTGATTCTTATTTTGTGGTTAAACAAACCACTCCTAGTAATTATGAACATGAGAAAGCTT GTTATGAAGACTTAAAGTCAGAAGTAACAGCTGATC ATGAT
TTCTTTGTGTTCAATAAGA ACATTTATAATATTAGTAGGCAGAGGCTTACTAAGTATACT
ATGATGGATTTTTGCTATG CTTTGCGGCACTTTGACCCAAAGGATTGCGAAGTTCTTAAAGAAATACTTGTCACTTATG
GTTGTATAGAAGATTATCACCCTAAGTGGTTTGAAGAGAATAAGGATTGGTACGACCCAA
TAGAAAACCCTAAATATTATGCCATGTTGGCTAAAATGGGACCTATTG TACGAGGTGCTT
TATTGAATGCTATTGAGTTCGGAAACCTCATGGTTGAAAAAGGTTATGTTGGTGTTATTA CACTTGATAACCAAGATCTTAATGGCAAATTTTATGATTTTG
GTGATTTTCAGAAGACAG CGCCTGGTGCTGGTGTTCCTGTTTTTGATACGTATTATTCTTA
CATGATGCCCATCATAG CCATGACTGATGCGTTGGCACCTGAGAGGTATTTTGAATAT
GATGTGCATAAGGGTTATA AATCTTATGATCTCCTCAAGTATGATTATACTGAGGAGAAACAAGATTTGTTTCAGAAGT

14

ACTTTAAGTATTGGGATCAAGAGTATCACCCTAACTGTCGCGACTGTAGTGATGACAGGT
GTTTGATACATTGTGCAAACTTCAACATCTTGTTTTCTACACTTGTACCGCAGACTTCTT TCGGTAATTTGTGTAGAAAGGTTTTTGTTGATGGTGTACCAT
TTATAGCTACTTGTGGCT ATCATTCTAAG GAACTTGGTGTTATTATGAATCAAGATAAC
ACCATGTCATTTTCAAAAA TGGGTTTGAGTGAACTCATGGAGTTTGTTGGAGATCGTGGC
TTGTTAGTGGGGACATGCA ATAAATTAGTGGATCTTAGAACGTCTTGTTTTAGTGTTTGTGCTTTAGCGTCTGGTATTA
18 CTCATCAAACGGTAAAACCAGGTCACTTTAACAAGGATTTCTACGATTTTGCAGAGAAGG

Стр. 27
США 10 130 701 B2
20 19 - продолжение CTGGTATGTTTAAGGAAGGTTCTTCTATACCACTTAAACATT
TCTTCTACCCACAGACTG GTAATGCTGCTATAAACGATTATGATTATTATCGTTATAACA
GGCCTACCATGTTTGATA TACGTCAACTTTTATTTTGTTTAGAAGTGACTTCTAAATATTTTGAATGTTATGAAGGCG
GCTGTATACCAGCAAGCCAAGTTGTAGTTAACAATTTAGATAAGAGTGCAGGTTATCCGT
TCAATAAGTTTGGAAAGGCCCGTCTCTATTATGAAATGAGTCTAGAGGAGCAGGACCAAC
TCTTTGAGAGTACAAAGAAGAACGTCCTGCCTACTATAACTCAGATGAATTTAAAATATG CCATATCCGCGAAAAATAGAGCGCGTACAGTGGCAGGTGT
GTCTATCCTTTCTACTATGA CTAATAGGCAGTTTCATCAGAAGATTCTTAAGTCTATAGTC
AACACTAGAAACG CTCCTG TAGTTATTGGAACAACCAAGTTTTATGGCGGTTGGGATAAC
ATGTTGAGAAACCTTATTC AGGGTGTTGAAGACCCGATTCTTATGGGTTGGGATTATCCAAAGTGTGATAGAGCAATGC
CTAATTTGTTGCGTATAGCAGCATCTTTAGTACTCGCTCGTAAACACACTAATTGTTGTA
CTTGGTCTGAACGCGTTTATAGGTTGTATAATGAATGCGCTCAGGTTTTATCTGAAACTG
TCTTAGCTACAGGTGGTATATATGTGAAACCTGGTGGTACTAGCAGTGGAGATGCTACTA CTGCTTATGCAAACAGTGTTTTCAACATAATACAAGCCACA
TCTGCTAATGTTGCGCGTC TTTTGAGTGTTATAACGCGTGATATTGTATATGATGACATTA
AGAGCTTGCAGTATGAAT TGTACCAGCAGGTTTATAGGCGAGTCAATTTTGACCCAGCATTTGTTGAAAAGTTTTATT
CTTATTTGTGTA AGAATTTCTCATTGATGATCTTGTCTGACG ACGGTGTTGTTTGTTATA
ACAACACATTAGCCAAACAAGGTCTTGTAGCAGATATTTCTGGTTTTAGAGAAGTTCTCT
ACTATCAGAACAATGTTTTTATGGCTGATTCTAAATGTTGGGTTGAACCAGATTTAGAAA AAGGCCCACATGAATTTTGTTCACAGCACACAATGTTAGTG
GAGGTTGATGGTGAGCCTA GATACTTGCCATATCCAGACCCAT CACGTATTTTGTGTGCAT
GTGTTTTTGTAGATGATT TGGATAAGACAGAATCTGTGGCTGTTATGGAGCGTTATATC
GCTCTTGCCATAGATGCGT ACCCACTAGTACATCATGAAAATGAGGAGTACAAGAAGGTATTCTTTGTGCTTCTTTCAT
ACATCAGAAAACTCTATCAAGAGCTTTCTCAGAATATGCTTATGGACTACTCTTTTGTAA
TGGATATAGATAAGGGTAGTAAATTTTGGGAACAGG AGTTC TATGAAAATATGTATAGAG
CCCACAACATTACAGTGTTGTGGCGTTTGTGTAGTGTGTAATAGTCAAACTATATTGC
GCTGTGGTAATTGTATTCGCAAACCATTTTTGTGTTGTAAGTGTTGCTATGACCATGTCA
TGCACACAGACCACAAAAATGTTTTGTCTATAAATCCTTACATTTGCTCACAGCCAGGTT GTGGTGAAGCAGATGTTACTAAATTGTACCTCGGAGGTATG
TCATACTTC TGCGGTAATC ATAAACCAAAGTTATCAATACCGTTAGTATCTAATGGTACA
GTGTTTGGAATTTACAGGG CTAATTGTGCAGGTAGCGAAAATGTTGATGATTTTAATCAA
CTAGCTACTACTAATTGGT CTACTGTGGAACCTTATATTTTGGCAAATCGTTGTGTAGATTCGTTGAGACGCTTTGCTG
CAGAGACAGTAAAAGCTACAGAAGAATTACATAAGCAACAATTTGCTAGTGCAGAAGTGA
GAGAAGTACTCTCAGATCGTGAATTGATTCTGTCTTGGGAGCCAGGTAAAACCAGGCCTC CATTGAATAGAAATTATGTTTTCACTGGCTTTCACTTTACTA
GAACTAGTAAAGTTCAGC TCGGTGATTTTACATTTGAAAAAGGTGAAGGTAAGGACGTT
GTCTATTATCGAGCGACGT CTACTGCTAAATTGTCTGTTGGAGACATTTTTGTTTTAACCTC
ACACAATGTTGTTTCTC TTATAGCGCCAACGTTGTGTCCTCAGCAAACCTTTTCTAGGTTTGTGAATTTAAGACCTA
ATGTGATGGTACCTGCGTGTTTTGTAAATAACATTCCATTGTACCATTTAGTAGGCAAGC
AGAAGCGTACTACAGTACAAGGCCCTCCTGGCAGTGGTAAATCCCATTTTGCTATAGGAT
Стр.28
США 10 130 701 B2 21 год - продолжение TGGCGGCTTACTTTAGTAACGCCC GTGTCGTTTTTACTGCAT GCTCTCATGCAGCTGTTG
ATGCTTTATGTGAAAAAGCTTTTAAGTTTCTTAAAGTAGATGATTGCACTCGTATAGTAC
CTCAAAGGACTACTATCGATTGCTTCTCTAAGTTTAAAGGTAATGACACAGGCAAAAAGT ACATTTTTAGTACTATTAATGCCTTGCCAGAAGTTAGTTGTG
ACATTCTTTTGGTTGACG AGGTTAGTATGTTGACCAATTACGAATTGTCTTTTA TTAATG
GTAAGATAAACTATCAAT ATGTTGTGTATGTAGGTGATCCTGCTCAATTACCGGCGCCTC
GTACGTTGCTTAACGGTT CACTCTCTCCAAAGGATTATAATGTTGTCACAAACCTTATGGTTTGTGTTAAACCTGACA
TTTTCCTTGCAAAGTGTTACCGTTGTCCTAAAGAAATTGTAGATACTGTTTCTACTCTTG
TATATGATGGAAAGTTTATTGCAAATAACCCGGAATCACGTCAGTGTT TCAAGGTTATAG
TTAATAATGGTAATTCTGATGTAGGACATGAAAGTGGCTCAGCCTACAACATAACTCAAT TAGAATTTGTGAAAGATTTTGTCTGTCGCAATAAGGAATGG
CGGGAAGCAACATTCATTT CACCTTATAATGCTATGAACCAGAGAGCCTACCGTATGCTT
GGACTTAATGTTCAGACAG TAGACTCGTCTCAAGGTTCGGAGTATGATTATGTTATCTTTTGTGTTACTGCAGATTCGC
AGCATGCACTGAATATTAACAGATTCAATGTAGCGCTTACAAGAGCCAAGCGTGGTATAC
TAGTTGTCATGCGTCAGCGTGATGAACTATATTCAGCTCTTAAGTTTATAGAGCTTGATA
GTGTAGCAAGTCTGCAAGGTACAGGCTTGTTTAAAATTTGCAACAAAGAGTTTAGTGGTG TTCACCCAGCTTATGCAGTCACAACTAAGGCTCTTGCTGCA
ACTTATAAAGTTAATGATG AACTTGCTGCA CTTGTTAACGTGGAAGCTGGTTCAGAAATA
ACATATAAACATCTTATTT CTTTGTTAGGGTTTAAGATGAGTGTTAATGTTGAAGGCTGCC
ACAACATGTTTATAACAC GTGATGAGGCTATCCGCAACGTAAGAGGTTGGGTAGGTTTTGATGTAGAAGCAACACATG

15

CTTGCGGTACTAACATTGGTACTAACCTGCCTTTCCAAGTAGGTTTCTCTACTGGTGCAG
ACTTTGTAGTTACGCCTGAGGGA CTTGTAGATACTTCAATA GGCAATAATTTTGAGCCTG TGAATTCTAAAGCACCTCCAGGTGAACAATTTAATCACTTG
AGAGCGTTATTCAAAAGTG CTAAACCTTGGCATGTTGTAAGGCCAAGGATTGTGCAAATG
TTAGCGGATAACCTGTGCA ACGTTTCAGATTGTGTAGTGTTTGTCACGTGGTGTCATGGCC
TAGAACTAACCACTTTGC GCTATTTTGTTAAAATAGGCAAGGACCAAGTTTGT TCTTGCG GTTCTAGAGCAACAACTT
TTAATTCTCATACTCAGGCTTATGCTTGTTGGAAGCATTGCTTGGGTTTTGATTTTGTTT
ATAATCCACTCTTAGTGGATATTCAACAGTGGGGTTATTCTGGTAACCTACAATTTAACC ATGATTTGCATTGTAATGTGCATGGACACGCACATGTAGCT
TCTGCGGATGCTATTATGA CGCGTTGTCTTGCAATTAATAATGCATTTTGTCAAGATGTCA
ACTGG GATTTAACTTACC CTCATATAGCAAATGAGGATGAAGTCAATTCTAGCTGTAGA
TATTTACAACGCATGTATC TTAATGCATGTGTTGATGCTCTTAAAGTTAACGTTGTCTATGATATAGGCAACCCTAAAG
GTATAAAATGTGTTAGACGTGGAGACTTAAATTTTAGATTCTATGATAAGAATCCAATAG
TACCCAATGTCAAGCAGTTTGAGTATGACTATAATCAGCACAAAGATAAGTTTGCTGAT G
GTCTTTGTATGTTTTGGAATTGTAATGTGGATTGTTATCCCGACAATTCCTTAGTTTGTA GGTACGACACACGAAATTTGAGTGTGTTTAACCTACCTGGT
TGTAATGGTGGTAGCTTGT ATGTTAACAAGCATGCATTCCACACACCTAAATTTGATCGC
ACTAGCTTTCGTAATTTGA AAGCTATGCCATTCTTTTTCTATGACTCATCGCCTTGCGAGACCATTCAATTGGATGGAG
TTGCGCAAGACCTTGTGTCATTAGCTACGAAAGATTGTATCACAAAATGCAACATAGGCG
GTGCTGTTTGTAAAAAGCACGCACAAATGTATGCAGATTTTGTGACTTCTTATAATGCAG
22 CTGTTACTGCTGGTTTTACTTTTTGGGTTACTAATAATTTTAACCCATATAATTTGTGGA
Стр.29
США 10 130 701 B2 23 - продолжение AAAGTTTTTCAGCTCTCCAGTCTAT CGACAATATTGCTTATA ATATGTATAAGGGTGGTC
ATTATGATGCTATTGCAGGAGAAATGCCCACTATCGTAACTGGAGATAAAGTTTTTGTTA
TAGATCAAGGCGTAGAAAAAGCAGTTTTTTTTAATCAAACAATTCTGCCTAGATCTGTAG
CGTTTGAGCTGTATGCGAAGAGAAATATTCGCACACTGCCAAACAACCGTATTTTGAAAG GTTTGGGTGTAGATGTGACTAATGGATTTGTAATTTG GGATT
ACACGAACCAAACACCAC TATACCGTAATACTGTTAAGGTATGTGCATATACAGACATA
GAACCAAATGGCCTAATAG TGCTGTATGATGATAGATATGGTGATTACCAGTCTTTTCTAG
CTGCTGATAATGCTGTTT TAGTTTCTACACAGTGTTACAAGCGGTATTCGTATGTAGAAATACCGTCAAACCTGCTTG
TTCAGAACGGTATTCCGTTAAAAGATGGAGCGAACCTGTATGTTTATAAGCGTGTTAATG
GTGCGTTTGTTACGCTACCTAACACATTAAACACACAGGGTCGCAGTTATGAAACTTTTG AACCTCGTAGTGATGTTGAGCGTGATTTTCTCGACATGTCTG
AGGAGAGTTTTGTAGAAA AGTATGGTAAAGAATTAGGTCTACAGCACATACTGTATGGT
GAAGTTGATAAGCCCCAAT TAGGTGGTTTAC ACACTGTTATAGGTATGTGCAGACTTTTAC
GTGCGAATAAGTTGAACG
CAAAGTCTGTTACTAATTCTGATTCTGATGTCATGCAAAATTATTTTGTATTGGCAGACA
ATGGTTCCTACAAGCAAGTGTGTACTGTTGTGGATTTGCTGCTTGATGATTTCTTAGAAC TTCTTAGGAACATACTGAAAGAGTATGGTACTAATAAGTCT
AAAGTTGTAACAGTGTCAA TTGATTACCATAGCATAAATTTTA TGACTTGGTTTGAAGATG
GCATTATTAAAACATGTT ATCCACAGCTTCAATCAGCATGGACGTGTGGTTATAATATG
CCTGAACTTTATAAAGTTC AGAATTGTGTTATGGAACCTTGCAACATTCCTAATTATGGTGTTGGAATAGCGTTGCCAA
GTGGTATTATGATGAATGTGGCAAAGTATACACACAACTCTGTCAATACCTTTCGAAAACAA
CAATGTGTGTACCGCATAATATGCGAGTAATGCA TTTTGGA GCTGGAAGTGACAAAGGAG TGGCTCCAGGTAGTACTGTTCTTAAACAATGGCTCCCAGAA
GGGACACTCCTTGTCGATA ATGATATTGTAGACTATGTGTCTGATGCACATGTTTCTGTGC
TTTCAGATTGCAATAAAT ATAAGACAGAGCACAAGTTTGATCTTGTGATATCTGATATG
TATACAGACAATGATTCAA AAAGAAAGCATGAAGGCGTGATAGCCAATAATGGCAATGATGACGT TTTCATATATCTCT
CAAGTTTTCTTCGTAATAATTTGGCTCTAGGTGGTAGTTTTGCTGTAAAAGTGACAGAGA
CAAGTTGGCACGAAGTTTTATATGACATTGCACAGGATTGTGCATGGTGGACAATGTTTT
GTACAGCAGTGAATGCCTCTTCTTCAGAAGCATTCTTGGTTGGTGTTAATTATTTGGGTG CAAGTGAAAAGGTTAAGGTTAGTGGAAAAACGCTGCACGC
AAATTATATTTTGGAGGA ATTGTAATTATTTACAAACCTCTGCTTATAGTATATTTGACG
TTGCTAAGTTTGATTTGA GATTGAAAGCAACACCAGTTGTTAATTTGAAAACTGAACAAAAGAGAGACTTAGTGTTTA
ATTTAATTAAGTGTGGTAAGTTACTGGTAAGAGATGTTGGTAACACCTCTTTTACTAGTG
TACCAAAGTGCCTTTAGACCACCTAATGGTTGGCATTTACACGGGGGTGCTTATGCGGTA
GTTAATATTTC TAGCGAATCTAATAATGCAGGCTCTTCACCT GGGTGTATTGTTGGTACT ATTCATGGTGGTCGTGTTGTTAATGCTTCTTCTATAGCTATG
ACGGCACCGTCATCAGGT ATGGCTTGGTCTAGCAGTCAGTTTTGTACTGCACACTGTAAC
TTTTCAGATACTACAGTG TTTGTTACACATTGTTATAAATATGATGGGTGTCCTATAACT
GGCATGCTTCAAAAGAAT TTTTTACGTGTTTCTGCTATGAAAAATGGCCAGCTTTTCTATAATTTAACAGTTAGTGTA
GCTAAGTACCCTACTTTTAAATCATTTCAGTGTGTTAATAATTTAACATCCGTATATTTA
24 AATGGTGATCTTGTTTACACCTCTAATGAGACCACAGATGTTACATCTGCAGGTGTTTAT

Стр.30
США 10 130 701 B2 25 - продолжение TTTAAAGCTGGTGGACCTATAACTT ATAAAGTTATGAGAGA
AGTTAAAGCCCTGGCTTAT TTTGTTAATGGTACTGCACAAGATGTTATTTTGTGTGATGGATCACCTAGAGGCTTGTTA
GCATGCCAGTATAATACTGGCAATTTTTCAGATGGCTTTTATCCTTTTATTAATAGTAGT
TTAGTTAAGCAGAAGTTTATTGTCTATCGTGAAAATAGTGTTAATACTACTTTTACGTTA CACAATTTCACTTTTCATAATGAGACTGGCGCCAACC CTAA
TCCTAGTGGTGTTCAGAAT ATTCAAACTTACCAAACACAAACAGCTCAGAGTGGTTATTA
TAATTTTAATTTTTCCTTT CTGAGTAGTTTTGTTTATAAGGAGTCTAATTTTATGTATGGA
TCTTATCACCCAAGTTGT

16

AATTTTAGACTAGAAACTATTAATAATGGCTTGTGGTTTAATTCACTTTCAGTTTCAATT
GCTTACGGTCCTCTTCAAGGTGGTTGCAAGCAATCTGTCTTTAGTGGTAGAGCAACTTGT TGTTATGCTTATTCATATGGAGGTCCTTCGCTGTGTAAAGGT
GTTTATTCAGGTGAGTTA GATCTTAATTTTGAATGTGGACTGTTAGTTTATGTTACTAAG
AGCGGTGGCTCTCGTATA CAAACAGCCACTGAACCGCCAGTTATAACTCGACACAATT
ATAATAATATTACTTTAAAT ACTTGTGTTGAT TATAATATATATGGCAGAACTGGCCAAGG TTTTATTACTAATGTAACC
GACTCAGCTGTTAGTTATAATTATCTAGCAGACGCAGGTTTGGCTATTTTAGATACATCT
GGTTCCATAGACATCTTTGTTGTACAAGGTGAATATGGTCTTACTTATTATTAGGTTAAC CCTTGCGAAGATGTCAACCAGCAGTTTGTAGTTTCTGGTGGT
AAATTAGTAGGTATTCTT ACTTCACGTAATGAGACTGGTTCT CAGCTTCTTGAGAACCA
GTTTTACATTAAAATCACT AATGGAACACGTCGTTTTAGACGTTCTATTACTGAAAATGTT
GGAAATTGCCCTTATGTT AGTTATGGTAAGTTTTGTATAAAACCTGATGGTTCAATTGCCACAATAGTACCAAAACAA
TTGGAACAGTTTGTGGCACCTTTACTTAATGTTACTGAAAATGTGCTCATACCTAACAGT
TTTAATTTAACTGTTACAGATGAGTACATACAAACG CGTAT GGATAAGGTCCAAATTAAT
TGTCTGCAGTATGTTTGTGGCAATTCTCTGGATTGTAGAGATTTGTTTCAACAATATGGG CCTGTTTGTGACAACATATTGTCTGTAGTAAATAGTATTGGT
CAAAAAGAAGATATGGAA CTTTTGAATTTCTATTCTTCTACTAAACCGGCTGGTTTTAATA
CACCATTTCTTAGTAAT GTTAGCACTGGTGAGTTTAATATTTCTCTTCTGTTAACAACTCCTAGT AGTCCTAGAAGG
CGTTCTTTTATTGAAGACCTTCTATTTACAAGCGTTGAATCTGTTGGATTACCAACAGAT
GACGCATACAAAAATTGCACTGCAGGACCTTTAGGTTTTCTTAAGGACCTTGCGTGTGCT
CGTGAATATAATGGTTTGCTTGTGTTGCCTCCCATTATAACAGCAGAAATGCAAATTTTG TATACTAGTTCTCTAGTAGCTTCTATGGCTTTTGGTGGTATTA
CTGCAGCTGGTGCTATA CCTTTTGCCACACAACTGCAGGCTAGAATTAATCACTTGGG
TATTACCCAGTCACTTTTG TTGAAGAATCAAGAAAAAATTGCTGCTTCCTTTAATAAGGC
CATTGGTCGTATGCAGGAA GGTTTTAGAAGTACATCTCTAGCATTACAACAAATTCAAGATGTTGTTAATAAGCAGAGT
GCTATTCTTACTGAGACTATGGCATCACTTAATAAAAATTTTGGTGCTATTTCTTCTATG
ATTCAAGAAAT CTACCAGCAACTTGACGCCATACAAGCAA ATGCTCAAGTGGATCGTCTT
ATAACTGGTAGATTGTCATCACTTTCTGTTTTAGCATCTGCTAAGCAGGCGGAGCATATT AGAGTGTCACAACAGCGTGAGTTAGCTACTCAGAAAATTA
ATGAGTGTGTTAAGTCACAG TCTATTAGGTACTCCTTTTGTGGTAATGGACGACATGTTCTA
ACCATACCGCAAAATGCA CCTAATGGTATAGTGTTTATACACTTTTCTTATACTCCAGATAGTTTTGTTAATGTTACT
GCAATAGTGGGTTTTTGTGTAAAGCCAGCTAATGCTAGTCAGTATGCAATAGTACCCGCT
AATGGTAGGGGTATTTTTATACAAGTTAATGGTAGTTACTACATCACAGCACGAGATATG
26 TATATGCCAAGAGCTATTACTGCAGGAGATATAGTTACGCTTACTTCTTGTCAAGCAAAT
Стр.31
США 10 130 701 B2 27 - продолжение
TATGTAAGTGTAAATAAGACCGTCATTACTACATTCGTAGACAATGATGATTTTGATTTT
AATGACGAATTGTCAAAATGGTGGAATGACACTAAGCATGAGCTACCAGACTTTGACAAA TTCAATTACACAGTACCTATACTTGACATTGATAGTGAAATT
GATCGTATTCAAGGCGTT ATACAGGGTCTTAATGACTCTTTAATAGACCTTGAAA AACT
TTCAATACTCAAAACTTAT ATTAAGTGGCCTTGGTATGTGTGGTTAGCCATAGCTTTTGCC
ACTATTATCTTCATCTTA ATACTAGGATGGGTTTTCTTCATGACTGGATGTTGTGGTTGTTGTTGTGGATGCTTTGGC
ATTATGCCTCTAATGAGTAAGTGTGGTAAGAAATCTTCTTATTACACGACTTTTGATAAC
GATGTGGTAACTTAACAATACAGACCTAAAAAGTCTGTTTAATGATTCAAAGTCCCACGT CCTTCCTAATAGTATTAATTTTTCTTTGGTGTAAACTTGTACT
AAGTTGTTTTAGAGAGT TTATTATAGCGCTCCAACAACTAATACAAGTTTTACTCCAA
ATTATCAATAGTAACTTAC AGCCTAGACTGACCCTTTGTCACAGTCTAGACTAATGTTAA
ACTTAGAAGCAATTATTGA AACTGGTGAGCA AGTGATTCAAAAAATCAGTTTCAATTTAC AGCATATTTCAAGTGTATT
AAACACAGAAGTATTTGACCCCTTTGACTATTGTTATTACAGAGGAGGTAATTTTTGGGA
AATAGAGTCAGCTGAAGATTGTTCAGGTGATGATGAATTTATTGAATAAGTCGCTAGAGG
AAAATGGAAGTTTTCTAACAGCGCTTTATATATTTGTAGGATTTTTAGCACTTTATCTTC TAGGTAGAGCACTTCAAGCATTTG TACAGGCTGCTGATGCT
TGTTGTTTATTTTGGTATA CATGGGTAGTAATTCCAGGAGCTAAGGGTACAGCCTTTGTA
TATAAGTATACATATGGTA GAAAACTTAACAATCGGGAATTAGAAGCAGTTATTGTCAACGAGTTTCCTAAGAACGGTT
GGAATAATAAAAATCCAGCAAATTTTCAAGATGTCCAACGAGACAAATTGTACTCTTGAC
TTTGAACAGTCAGTTGAGCTTTTTAAAGAGTATAAT TTATTT ATAACTGCATTCTTGTTG
TTCTTAACCATAATACTTCAGTATGGCTATGCAACAAGAAGTAAGTTTATTTATATACTG AAAATGATAGTGTTATGGTGCTTTTGGCCCCTTAACATTGCA
GTAGGTGTAATTTCATGT ATATACCCACCAAACACAGGAGGTCTTGTCGCAGCGATAA
TACTTACAGTGTTTGCGTGT CTGTCTTTTGTAGGTTATTGGATCCAGAGTATTAGACTCTTT
AAGCGG TGTAGGTCATGG TGGTCATTTAACCCAGAATCTAATGCCGTAGGTTCAATACTCCTAACTAATGGTCAACAA
TGTAATTTTGCTATAGAGAGTGTGCCAATGGTGCTTTCTCCAATTATAAAGAATGGTGTT
CTTTATTGTGAGGGTCAGTGGCTTGCTAAGTGTGAACCAGACCACTTGCCTAAAGATATA
TTTGTTTGTACACCGGATAGACGTAATATCTACCGTATGGTGCAGAAATATACTGGTGAC CAAAGCGGAAATAAGAAACGGTTTGCTACGTTTGTCTATGC
AAAGCAGTCAGTAGATACT GGCGAGCTAGAAAGTGTAGCAACAGGAGGGAGTAGTCTTT
ACACCTAAATGTGTGTGTGT AGAGAGTATTTAAAATTATTCTTTAATAGTGCCTCTATTTTAAGAGCGCATAATAGTATT
ATTTTTGAGGATATTAATATAAATCCTCTCTGTTTTATACTCTCTTTTCAAGAGCTATTA
TTTAAAAAACA GTTTTTCCACTCTTTTGTGCCAAAAACTATT GTTGTTAATGGTGTAACC
TTTCAAGTAGATAATGGAAAAGTCTACTACGAAGGAAAACCAATTTTTCAGAAAGGTTGT TGTAGGTTGTGGTTGAGTTATAAAAAAGATTAAACTACCTA
CTACACTTATTTTTATAAG AGGCGTTTTATCTTACAAGCGCTTAATAAATACGGACGATG
AAATGGCTGACTAGTTTTG TAAGGGCAGTTATTTCATGTTATAAACCCCTATTATTAACTC
AATTAAGAGTATTAGATA

17

GGTTAATCTTAGATCATGGACCAAAACACATCTTAACGTGTGTTAGGTGCGTGATTTTGT
TTCAATTAGATTTAGTTTATAGGTTGGCGTATACGCCTACTCAATCGCTGGTATGAATAA 28 TAGTAAAGATAATCCTTTTTGCGGAGCAATAGCAAGAAAAGCGCGAATTTATCTGAGAGA

Стр.32
США 10 130 701 B2 29 30 - продолжение AGGATTAGATTGTGTTTACTTTCTTAACAAAGCAGGACAAGCAGAGTCTTGTCCCGCGTG
TACCTCTCTAGTATTCCAGGGGAAAACTTGTGAGGAACACAAATATAATAATAATCTTTT
GTCATGGCAAGCGGTAAGGCAACTGGAAAGACAGATGCCCCAGCTCCAGTCATCAAACTA
GGAGGACCAAAGCCACCTAAAGTTGGTTCTTCTG GAAATGT ATCTTGGTTTCAAGCAATA AAAGCCAAGAAGTTAAATTCACCTCCGCCTAAGTTTGAAGG
TAGCGGTGTTCCTGATAAT GAAAATCTAAAACCAAGTCAGCAGCATGGATATTGGAGAC
GCCAAGCTAGGTTTAAGCCA GGTAAAGGTGGAAGAAAACCAGTCCCAGATGCTTGGTATTTTTAGTATACTGGAACAGGA
CCAGCCGCTAACCTGAATTGGGGTGATAGCCAAGATGGTATAGTGTGGGTTGCTGGTAAG
GGTGCTGATACTAAATTTAGATCTAATCAGGGTACTCGTGACTCTGACAAGTTTGACCAA
TATCCGCTACGGTTTTCAGACGGAGGACCTGATGGTAATTTCCGTTGGGATTTCATTCCT CTGAATCGTGGCAGGAGTGGGAGATCAACAGCAGCTTCAT
CAGCAGCATCTAGTAGAGCA CCATCACGTGAA GTTTCGCGTGGTCGCAGGAGTGGTTCTGA
AGATGATCTTATTGCTCGT GCAGCAAGGATAATTCAGGATCAGCAGAAGAAGGGTTCTC
GCATTACAAAGGCTAAGGCT GATGAAATGGCTCACCGCCGGTATTGCAAGCGCAGTATTCCACCTAATTATAAGGTTGAT
CAAGTGTTTGGTCCCCGTACTAAAGGTAAGGAGGGAAATTTTGGTGATGACAAGATGAAT
GAGGAAGGTATTAAGGATGGGCGC GTTACAGCAATGCTCA ACCTAGTTCCTAGCAGCCAT
GCTTGTCTTTTCGGAAGTAGAGTGACGCCCAGACTTCAACCAGATGGGCTGCACTTGAAA TTTGAATTTACTACTGTGGTCCCACGTGATGATCCGCAGTTT
GATAATTATGTAAAAATT TGTGATCAGTGTGTTGATGGTGTAGGAACACGTCCAAAAGA
TGATGAACCAAGACCAAAG TCACGCTCAAGTTCAAGACCTGCAACAAGAGGAAAT TCTCC AGCGCCAAGACAGCAGCGC
CCTAAGAAGGAGAAAAAGCCAAAGAAGCAGGATGATGAAGTGGATAAAGCATTGACCTCA
GATGAGGAGAGGAACAATGCACAGCTGGAATTTGATGATGAACCCAAGGTAATTAACTGG
GGGGATTCAGCGCTAGGAGAGAATGAACTTTGAGTAAAATTGAATAGTAAGAGTTAAGGA AGATAGGCATGTAGCTTGATTACCTACATGTCTATCGCCAG
GGAAATG TCTAATTTGTCT ACTTAGTAGCCTGGAAACGAACGGTAGACCCTTAGATTTTA
ATTTAGTTTAATTTTTAGT TTAGTTTAAGTTAGTTTAGAGTAGGTATAAAGATGCCAGTG
GCGGGGCCACGCGGAGTAC GACCGAGGGTACAGCACTAGGACGCCCATTAGGGGAAGAGCTAAATTTTAGTTTAAGTTA
AGTTTAATTGGCTATGTATAGTTAAAATTTATAGGCTAGTATAGAGTTAGAGCAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA





Репликация Помимо структурных и вспомогательных генов, два -
треть генома коронавируса состоит из гена replicase (на 5' -конце генома), что выражается двумя
полипротеины, ppla и pplab, в которых pplab является расширением
продукт образования ppla в результате сдвига рибосомы -1 механизм. Два полипротеина расщепляются на два типа кодируемых вирусом протеиназ обычно приводит к 16 не -
структурные белки (Nspl -16); IBV не имеет Nspl, поэтому кодировка Nsp2 -16.
Таким образом, Ген 1 в IBV кодирует 15 (16 в других коронавирусах).
ruses) неструктурные белки (nsp2 -16), которые связаны с репликацией и транскрипцией РНК.
Термин «белок replicase » используется здесь для обозначения полипротеины ppla и pplab или отдельные субъединицы nsp.
Термин «ген replicase » используется здесь для обозначения последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует
белки replicase . Краткое описание функций белков nsp коронавируса
приведено ниже. приведено в таблице 1.
ТАБЛИЦА 1 50 ------------------------------------------------- ---------- Nsp
Протеин Ключевые особенности
1 Консервативны внутри , но не между коронавируса генетических
группы; потенциальные регуляторные функции в клетке - хозяине. 2 Незаменим для репликации MHV и SARS -CoV в
культура ткани 3 Кислотный домен; макро домен с ADRP и поли
(АДФ -рибоза) -связывающая активность; один или два ЗБД - содержащие папаин -подобные протеазы; Y домен 4 Трансмембранный домен
5 3C-подобная основная протеаза, гомодимер 6 Транс мембранный домен
7 Взаимодействует с nsp8 , чтобы сформировать в hexadecamer комплекс
8 Неканноническая РНК -полимераза; взаимодействует с nsp7 для образования гексадекамерн ного комплекс а 9 ssRNA -связывающий белок, димер
10 РНК -связывающий белок , гомододекамер, цинк - связывающий домен, известный взаимодействовать
с nspl4 и nspl6

Стр. 33
США 10 130 701 B2 31 год ТАБЛИЦА 1 (продолжение)
Nsp Протеин Ключевая особенность
11 Неизвестно 12 РНК -зависимая РНК - полимераза
13 Цинк -связывающий домен, NTPase, dNTPase, 5' -to-3 'РНК и ДНК -геликаза, РНК 5' -трифосфат 14 3'- 5'-экзорибонуклеаза, цинк -связывающий домен и N7 -
метилтрансфераза 15 Уридилат -специфическая
эндорибонуклеаза, гомогексамер 16 Предполагаемая рибоз о-2'-O-метилтрансфераза

18

Вариант гена репликазы, кодируемый коронавирусом настоящее изобретение включает мутацию в одном или
нескольких участков последовательности, кодирующих nsp - 10, nsp -14, nsp -15 или нсп -16.
NsplO обладает РНК -связывающей активностью и, по- видимому,участвует в гомо и / или гетеротипических
взаимодействиях внутри другие НПБ из области ppla / pplab. Он принимает складку A
/ P состоит из пяти а -спиралей, одной 310 -спирали и трех П-прядь. Были идентифицированы два сайта связывания
цинка, кото рые образованы консервативными остатками цистеина и одним гистидином остаток (Cys -74 / Cys -77 / His -
83 / Cys -90; Cys -117 / Cys -120 / Cys -128 / Cys -130). Было подтверждено, что белок связывает одноцепочечные и двухцепочечные РНК и ДНК без очевидная специфика . Nsp -
10 может быть сшит с nsp -9,предполагая существование сложной сети белков
белковые взаимодействия с участием nsp -7, -8, -9 и -10. В кроме того, известно, что nsp -10 взаимодействует с nsp -14 и
НСП -16. 32 Nsp -14 включает экзорибонуклеазу с 3' -на-5'' (ExoN)
активный домен в аминоконцевой области. SARS -CoV ExoN обладает зависимостью от ионов металлов. Экзорибонуклеазная активность 3' -к-5 ', которая действует как
на отдельные одноцепочечные и двухцепочечные РНК, но не на ДНК. Nsp -14, как было показано, и меют активность по
корректуре. Это nspтакже было показано наличие N7 - метилтрансферазы (МТ)активность в карбоксиконцевой
области. Nsp -15-ассоциированная NendoU (нидовирусная эндорибонуклеаза,специфическая для U) РНКазная
активность описана для коронавирусов , включая SARS -CoV, MHV иIBV. Постоянно сообщалось, что деятельность была
значительной. Незначительно усилен ионами Mn2 +, и активность в
наличие Mg2 + и Ca2 +. NendoU раскалывает на 3 ' стороне уридилатных остатков как в одноцепочечной, так и в двухцепоче чная РНК. Биологически значимый субстрат (ы)
коронавируса NendoUs еще предстоит идентифицировать. Было предсказано, что Nsp -16 опосредует рибозо -2'-O-мет -
активность илтрансферазы (2' -O-MTase) и обратная генетика эксперименты показали, что домен 2' -O-MTase необходим для синтеза вирусной РНК в HCoV -229E и SARS -
CoV. Фермент может участвовать в производстве cap 1 структуры РНК коронавируса, а также может
сотрудничать с NendoU и ExoN в обработке других РНК пути. 2'-O-MTase может также метилировать специфически е
РНК чтобы защитить их от NendoU -опосредованного расщепления. Геномные и белковые последовательности для nsp -10, -14, -15
и -16 представлены как SEQ ID NO: 2 -5 и 6 -9, соответственно. (Нуклеотидная последовательность nsp -10 -
нуклеотиды 11884 -12318 из SEQ ID NO: 1)
SEQ ID NO: 2 TCTAAAGGTCATGAGACAGAGGAAGTGGATGCTGTAGGCA
TTCTCTCACTTTGTTCTTTTGCAGTA GATCCTGCGGATACATATTGTAAATATGTGGCAGCAGGTAA
TCAACCTTTAGGTAACTGTGTTAAA ATGTTGACAGTACATAATGGTAGTGGTTTTGCAATAACATC
AAAGCCAAGTCCAACTCCGGATCAG GATTCTTATGGAGGAGCTTCTGTGTGTCTTTATTGTAGAGCACATATAGCACACCTTGGCGGAGCA
GGAAATTTAGATGGACGCTGTCAATTTAAAGGTTCTTTTGTGCAAATACCTACTACGGAGAAAGAT
CCTGTTGGATTCTGTCTACGTAACAAGGTTTGCACTGTTTGTCAGTGTTGGATTGGTTATGGATGT CAGTGTGATTCACTTAGACAACCTAAACCTTCTGTTCAG
(Нуклеотидная последовательность nsp -14 - нуклеотиды 16938 - 18500 из SEQ ID NO:
1) SEQ ID NO:
3 GGTACAGGCTTGTTTAAAATTTGCAACAAAGAGTTTAGTGGTGTTCACCCAGCTTATGCAGTCACA
ACTAAGGCTCTTGCTGCAACTTATAAAGTTAATGATGAACTTGCTGCACTTGTTAACGTGGAAGCT
GGTTCAGAAATAACATATAAACATCTTATTTCTTTGTTAGGGTTTAAGATGAGTGTTAATGTTGAA
GGCTGCCACAACATGTTTATAACACGTGATGAGGCTATCCGCAACGTAAGAGGTTGGGTAGGTTTT GATGTAGAAGCAACACATGCTTGCGGTACTAACATTGGTAC
TAACCTGCCTTTCCAAGTAGGTTTC TCTACTGGTGCAGACTTTGTAGTTACGCCTGAGGGACTTGTA
GATACTTCAATAGGCAATAATTTT GAGCCTGTGAATTCTAAAGCACCTCCAGGT GAACAATTTAA TCACTTGAGAGCGTTATTCAAAAGT
GCTAAACCTTGGCATGTTGTAAGGCCAAGGATTGTGCAAATGTTAGCGGATAACCTGTGCAACGTT
TCAGATTGTGTAGTGTTTGTCACGTGGTGTCATGGCCTAGAACTAACCACTTTGCGCTATTTTGTT
AAAATAGGCAAGGACCAAGTTTGTTCTTGCGGTTCTAGAGCAACAACTTTTAATTCTCATACTCAG GCTTATGCTTGTTGGAAG CATTGCTTGGGTTTTGATTTTGTTT
ATAATCCACTCTTAGTGGATATT CAACAGTGGGGTTATTCTGGTAACCTACAATTTAACCATGA
TTTGCATTGTAATGTGCATGGACAC GCACATGTAGCTTCTGCGGATGCTATTATGACGCGTTGTCTT
GCAATTAATAATGCATTTTGTCAA

Стр. 34
США 10 130 701 B2
33 34 -продолженный
GATGTCAACTGGGATTTAACTTACCCTCATATAGCAAATGAGGATGAAGTCAATTCTAGCTGTAGA TATTTACAACGCATGTATCTTAATGCATGTGTTGATGCTCTT
AAAGTTAACGTTGTCTATGATATA GGCAACCCTAAAGGTATTAAATGTGTTAGACGTGGAGACTT
AAATTTTAGATTCTATGATAAGAAT CCAATAGTACCCAATGTCAAGCAGTTTGAGTATGACTATAATCAGCACAAAGATA AGTTTGCTGAT
GGTCTTTGTATGTTTTGGAATTGTAATGTGGATTGTTATCCCGACAATTCCTTACTTTGTAGGTAC
GACACACGAAATTTGAGTGTGTTTAACCTACCTGGTTGTAATGGTGGTAGCTTGTATGTTAACAAG
CATGCATTCCACACACCTAAATTTGATCGCACTAGCTTTCGTAATTTGAAAGCTATGCCATTCTTT TTCTATGACTCATCGCCTTGCGAGACCATTCAATTGGATGG
AG TTGCGCAAGACCTTGTGTCATTA GCTACGAAAGATTGTATCACAAAATGCAACATAGGCGGTG
CTGTTTGTAAAAAGCACGCACAAATG TATGCAGATTTTGTGACTTCTTATAATGCAGCTGTTACTGCT
GGTTTTACTTTTTGGGTTACTAAT AATTTTAACCCATATAATTTGTGGAAAAGTTTTTCAGCTCTCCAG
( Нуклеотидная последовательность nsp -15 - нуклеотид ы 18501 -19514 из SEQ ID NO:
1) SEQ ID NO:
4 TCTATCGACAATATTGCTTATAATATGTATAAGGGTGGTCATTATGATGCTATTGCAGGAGAAATG
CCCACTATCGTAACTGGAGATAAAGTTTTTGTTATAGATCAAGGCGTAGAAAAAGCAGTTTTTTTT
AATCAAACAATTCTGCCTACATCTGTAGCGTTTGAGCTGTATGCGAAGAGAAATATTCGCACACTG CCAAACAACCGTATTTTGAAAGGTTTGGGTGTAGATGTGAC
TAATGGATTTGTAATTTGGGATTAC ACGAACCAAACACCACTATACCGTAATACTGTTAAGGTATG
TGCATATACAGACATAGAACCAAAT GGCCTAATAGTGCTGTATGATGATAGATATGGTGATTACCA
GTCTTTTCTAGCTGCTGATAATGCT

19

GTTTTAGTTTCTACACAGTGTTACAAGCGGTATTCGTATGTAGAAATACCGTCAA ACCTGCTTGTT
CAGAACGGTATTCCGTTAAAAGATGGAGCGAACCTGTATGTTTATAAGCGTGTTAATGGTGCGTTT GTTACGCTACCTAACACAATAAACACACAGGGTCGAAGTT
ATGAAACTTTTGAACCTCGTAGTGAT GTTGAGCGTGATTTTCTCGACATGTCTGAGGAGAGTTTTGTA
GAAAAGTATGGTAAAGAATTAGGT CTACAGCACATACTGTATGGTGAAGTTGATAAGCCCCAATT
AG GTGGTTTCCACACTGTTATAGGT ATGTGCAGACTTTTACGTGCGAATAAGTTGAACGCAAAGTCTGTTACTAATTCTGATTCTGATGTC
ATGCAAAATTATTTTGTATTGGCAGACAATGGTTCCTACAAGCAAGTGTGTACTGTTGTGGATTTG
CTGCTTGATGATTTCTTAGAACTTCTTAGGAACATACTGAAAGAGTATGGTACTAATAAGTCTAAA GTTGTAACAGTGTCAATTGATTACCATAGCA TAAATTTTATG
ACTTGGTTTGAAGATGGCATTATT AAAACATGTTATCCACAGCTTCAA
(Нуклеотидная последовательность nsp -16 - нуклеотиды 19515 - 20423 SEQ ID NO:
1) SEQ ID NO: 5
TCAGCATGGACGTGTGGTTATAATATGCCTGAACTTTATAAAGTTCAGAATTGTGTTATGGAACCT
TGCAACATTCCTAATTATGGTGTTGGAATAGCGTTG CCAAG TGGTATTATGATGAATGTGGCAAAG
TATACACAACTCTGTCAATACCTTTCGAAAACAACAATGTGTGTACCGCATAATATGCGAGTAATG CATTTTGGAGCTGGAAGTGACAAAGGAGTGGTGCCAGGTA
GTACTGTTCTTAAACAATGGCTCCCA GAAGGGACACTCCTTGTCGATAATGATATTGTAGACTATGT
GTCTGATGCACATGTTTCTGTGCTT TCAGATTGCAATAAATATAAGACA GAGCACAAGTTTGATCT TGTGATATCTGATATGTATACAGAC
AATGATTCAAAAAGAAAGCATGAAGGCGTGATAGCCAATAATGGCAATGATGACGTTTTCATATAT
CTCTCAAGTTTTCTTCGTAATAATTTGGCTCTAGGTGGTAGTTTTGCTGTAAAAGTGACAGAGACA
AGTTGGCACGAAGTTTTATATGACATTGCACAGGATTGTGCATGGTGGACAATGTTTTGTACAGCA GTGAATGCCTCT TCTTCAGAAGCATTCTTGATTGGTGTTAAT
TATTTGGGTGCAAGTGAAAAGGTT AAGGTTAGTGGAAAAACGCTGCACGCAAATTATATATTTTG
GAGGAATTGTAATTATTTACAAACC

Стр. 35
США 10 130 701 B2 35 год 36 -продолженный
TCTGCTTATAGTATATTTGACGTTGCTAAGTTTGATTTGAGATTGAAAGCAACGCCAGTTGTTAAT
TTGAAAACTGAACAAAAGACAGACTTAGTCTTTAATTTAATTAAGTGTGGTAAGTTACTGGTAAGA GATGTTGGTAACACCTCTTTTACTAGTGACTCTTTTGTGTGT
ACTATGTAG (NSP -10 аминокислот кислоты последовательности)
SEQ ID NO: 6
SKGHETEEVDAVGILSLCSFAVDPADTYCKYVAAGNQPLGNCVKMLTVKNGSGFAITSKPSPTPDQ DSYGGASVC LYCRAHIAHPGGAGNLDGRCQFKGSFVQIPTTEK
DPVGFCLRNKVCTVCQCWIGYGC QCDSLRQPKPSVQ
(NSP -14 аминокислот кислоты последовательности) SEQ ID NO: 7
GTGLFKICNKEFSGVHPAYAVTTKALAATYKVNDELAALVNVEAGSEITYKHLISLLGFKMSVNVE
GCHNMFITRDEAIRNVRGWVGFDVEATHACGTNIGTNLPFQVGFSTGADFVVTPEGLVDTSIGNNF
EPVNSKAPPGEQFNHLRALFKSAKPWHWRPRIVQMLADNLCNVSDCWFVTWCHGLELTTLRYFV
KIGKDQVCSCGSRATTFNSHTQAYACWKHCLGFDFVYNPLLVDIQQWGYSGNLQFNHDLHCNVHGH AHVASADAIMTRCLAINNAFCQDVNWDLTYPHIANEDEVNSS
CRYLQRMYLNACVDA LKVNVVYDI GNPKGIKCVRRGDLNFRFYDKNPIVPNVKQFEYDYNQHKDKF
ADGLCMFWNCNVDCYPDNSLVCRY DTRNLSVFNLPGCNGGSLYVNKHAFHTPKFDRTSFRNLKAMPF
FFYDSSPCETIQLDGVAQDLVSL ATKDCITKCNICGAVCKKKAQMYADFVTSYNAAVTAGFTFWVTNNFNPYNLWKSFSALQ
(NSP -15 аминокислот кислоты последовательности) SEQ ID NO:
8 SIDNIAYNMYKGGHYDAIAGEMPTIVTGDKVFVIDQGVEKAVFFNQTILPTSVAFELYAKRNIRTL
PNNRILKGLGVDVTNGFVIWDYTNQTPLYRNTVKVCAYTDIEPNGLIVLYDDRYGDYQSFLAADNA
VLVSTQCYKRYSYVEIPSNLLVQNGIPLKDGANLYVYKRVNGAFVTLPNTLNTQGRSYETFEPRSD
VERDFLDMSEESFVEKYGKELGLQHILYGEVDKPQLGGLHTVIGMC RLLRANKLNAKSVTNSDSDV MQNYFVLADNGSYKQVCTVVDLLLDDFLELLRNILKEYGTNKS
KVVTVSIDYHSINFMTWFEDGII KTCYPQLQ
(NSP -16 аминокислот кислоты последовательности) SEQ ID NO:
9 SAWTCGYNMPELYKVQNCVMEPCNIPNYGVGIALPSGIMMNVAKYTQLCQYLSKTTMCVPHNMRVM
HFGAGSDKGVAPGSTVLKQWLPEGTLLVDND IVDYVSDAHVS VLSDCNKYKTEHKFDLVISDMYTD
NDSKRKHEGVIANNGNDDVFIYLSSFLRNNLALGGSFAVKVTETSWHEVLYDIAQDCAWWTMFCTA VNASSSEAFLVGVNYLGASEKVIWSGKTLHANYIFWRNCNYLQ
TSAYSIFDVAKFDLRLKATPVVN LKTEQKTDLVFNLIKCGKLLVRDVGNTSFTSDSFVCTM
Пониженная патогенность
Живой аттенуированный коронавирус по настоящему изобретению содержит вариантный ген репликазы, который заставляет вирус иметь пониженную патогенность по
сравнению с коронавирусом экспрессирующий соответствующий ген дикого типа.
Термин «аттенуированный» в контексте настоящего оп исания относится к вирусу, который
проявляет указанную пониженную патогенность и может быть классифицирован как невирулентный. Живой аттенуированный вирус - это
ослабленный реплик. cating вирус все еще способен стимулировать иммунный ответ
и вызывает иммун итет, но не вызывает болезнь. Термин «патогенность» используется здесь в соответствии с
его нормальное значение для обозначения способности вируса вызывать
болезнь. Обычно патогенность коронавирус а определяется путем анализа симптомов, связанных с заболева нием
такими , например чихание, хихиканье и уменьшение цилиарная активность трахеи. Термин «пониженная патогенность» используется для
описания этого: снижен уровень патогенности коронавируса, уменьшен или уменьшен по сравнению с соответствующим
диким типом коронавирус а. В одном варианте реализации коронавирус по настоящему
изобретению имеет пониженную патогенность по сравнению с родительским . Вирус M41 -CK, от которого он был получен, или контроль
коронавирус. Контрольным коронавирусом может стать коронавиру сом с известной патогенностью, например
коронавирус экспрессия белка репликазы дикого типа. Патогенность коронавируса может быть оценен

20

используя методы, хорошо известные в данной области. Обычно патогенные
генность оценивается путем анализа клинических си мптомов у субъект а, зараженного вирусом, например курица. Например, курицу можно бросить вызов в 8 -24.
дней при интраназальной или глазной инокуляции. Клинические симптомы,
ассоциированный с инфекцией IBV, может оцениваться через 3-10 дней. Клинические си мптомы обычно оцениваются как
постинфекция .

Стр.36
США 10 130 701 B2
37 определить патогенность коронавируса, например IBV, включая удушье, кашель, чихание, хихиканье, депрессию
взъерошенность, взъерошенность перьев и потеря цилиарной активности трахеи.
Вариант репликазы по настоящему изобретению, когда выраженный в коронавирусе, может вызвать снижение уровня клинические симптомы по сравнению с коронавирусом,
выражающимрепликаза дикого типа. Например, коронавирус, выражающий вариант repli
случай может вы звать количество укусов на птицу в минуту что меньше 90%, меньше 80%, меньше 70%, меньше
более 60%, менее 50%, менее 40%, менее 30%, менее более 20% или менее 10% от количества уколов, вызванных вирусом, экспрессирующим репликазу дикого типа.
Коронавирус, экспрессирующий вариантную репликазу согласно настоящему изобретению может вызывать хрипы
менее чем в 70% случаев,менее 60%, менее 50%, менее 40%, менее 30%,менее 20% или менее 10% от количества птиц в
Ста е зараженнных вирусом дикого типа репликаза. Корон авирус, экспрессирующий вариантную репликазу по 20 настоящее изобретение может привести к цилиарной
активности трахеи , что составляет не менее 60%, не менее 70%, не менее 80%, не менее 90% или не менее 95% от уровня
активности ресничек трахеи в незараженны е птицы. Коронавирус, экспрессирующий вариантную репликазу по 25 настоящее изобретение может вызывать клинические
симптомы, так как определено в таблице 2, на более низком уровне, чем коронавирус экспрессирующие репликазу дикого
типа.
ТАБЛИЦА 2 38 уровни при введении цыплятам -бройлерам с материнским
антитела ми , поскольку эти штаммы нейтрализуются материнским пул антител. Таким образом, вирусная частица должна быть достаточно
эффективной при 5 размножение и размножение, чтобы гарантировать, что он не является нейтральным
обусловлены материнскими антителами против вируса. Антитела материнского происхождения - это ограниченный
пул эффективных антитела, количество которых уменьшается с возрастом цыпленка, и neu подобная обработка вируса не означает
10 уст ановление длительного иммунитета у эмбриона / цыпленка.
Чтобы выработать длительный иммунитет против вируса, эмбрион и вылупившийся цыпленок должны развить
соответствующий защитный иммунный ответ, который отличается от эффекта антител материнского происхож дения. Чтобы быть полезным для вакцинации in ovo, вирус также не
должен реплицироваться и распространяться на уровне, который заставляет его патогенны для эмбриона.
Пониженная патогенность эмбриона может означать что коронавирус вызывает меньшее снижение в ыводимости по сравнению с соответствующим контрольным
коронавирусом дикого типа. Таким образом, термин «не являющийся патогенным для
эмбриона» в контексте настоящего изобретения может означать « не вызывает снижение выводимости »по сравнению
с контрол ьным коронавирус ом.
Подходящий вариант репликазы можно идентифицировать с помощью методов, известных в данной области
техники. Например сравнительный провокационные эксперименты после вакцинации in ovo IBV пределы тяжести , основанные на клинических признаках:
Хихикает (чихает) Назальный экссудат
Слезящиеся глаза Опухшие подглазничные пазухи
Хрипы (вибрация в области трахеи или бронхов) Специфично для ИБК: легкая (примечание: респираторные симптомы.
становятся очевидными с 2 –3 точек на дюйм, если они которые соби раются произойти и может продолжаться
до 7d). Сгорбленная осанка / депрессивное состояние Взбитые до перьев
- Ешьте и пейте меньше
Питьевой в избытке: очевидно , по текучей среде , заполненной культуры или
измеренный водозабор Легкая, если больше 2d, увеличение до умеренный
Специфично для ИБК : легкая, если превышает 24 часа, увеличивается до
умеренные для более макс 2d. Если все еще пьешь в избытке затем убить методом расписания 1.
Менее активен, но все же уклоняется от захвата Потеря веса .
Не есть и не пить Легкая, при превышении Id увеличивается до
умеренного . Птицы сидят в одиночку и вовсе не уклоняться от захвата Тяжелая
респираторная недостаточность: например, сильное дыхание Смех и / или хрип на 7 дней в сумме
Найден мертвым --------- ------------------- Умеренный: птицы в конечной точке. Убить по расписанию 1
метод. Тяжелая: сообщить о лицензии проекта держателя . Необходимо провести полное вскрытие .
Вариант репликазы по настоящему изобретению, когда экспрессируется в коронавирусе, мож ет вызвать репликацию
вируса на непатогенных уровнях in ovo.
При разработке вакцин для введения in ovo в куриные эмбрионы следует обратить внимание на два момента:
влияние материнских антител на вакцины и эффект вакцины на эмбрионе. Материнские антитела
известно, что мешает активной иммунизации. Например, вакцины с мягкими штаммами не индуцируют защитных
антител эмбрионы с антителами материнского происхождения или без них могут быть выявлены (т.е. когда уровень был или не был
вакцинирован против ИБК). Есл и вариантная репликаза позволяет вирусу размножаться
уровень слишком высокий, эмбрион не вылупится или не будет жизнеспособным после вылупления (т.е. вирус является патогенным для эмбрион а). Вирус, патогенный для эмбриона,
может убить эмбрион а. Если вариан тная репликаза вызывает снижение вирусных
реплик , слишком сильное распространение и распространение, вирус будет
Стр. 37
США 10 130 701 B2 -продолженный
нейтрал изуется материнскими антителами. Subse Поэтому если цыпленок заражен ИБК,
при развитии клинических симптомов (например,

21

свистящее дыхание, хихиканье, потеря активности ресничек) и нача лось заболевание у зараженного цыпленка; как это не
удалось выработать эффективный иммунитет против вируса. Вариант
Используемый здесь термин «вариант» является синонимом «мутант» и относится к последовательности нуклеиновой
кислоты или аминокислоты. который отличается от соответствующего дикого типа
последовательность. Вариант / мутантная последовательность может возникать естественным путем или может бы ть
созданы искусственно (например, сайт -направленным мутагеном
esis). Мутант может иметь не менее 70, 80, 90, 95, 98 или 99% идентичность последовательности с соответствующей частью дикой природы
последовательность типов. У мутанта может быть менее 20, 10, 5, 4,
3, 2 или 1 мутация (и) в соответствующей части последовательность дикого типа.
Термин «дикий тип» используется для обозначения гена или белка. имеющий идентичную нуклеотидную или аминокислотную
последовательность с нативным геном или белком соответс твенно (т.е.
вирусный ген или белок). Сравнение идентичности можно проводить на глаз или более
обычно, с помощью легко доступных сравнений последовательностей программы. Эти коммерчески доступные компьютерные программы могут вычислить%
идентичности между д вумя или более последовательности. Подходящая компьютерная программа
для проведения такой расклад - пакет GCG Wisconsin Bestfit (Университет Висконсина, США; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387). Примеры других софт
ПО, которое может выпо лнять сравнение последовательностей, включает, но
не ограничиваются пакетом BLAST (см. Ausubel et al., 1999, там же - Глава 18), FASTA (Atschul et al, 1990, J.
Мол. Биол, 403 -410) и пакет GENEWORKS ком. инструменты для обработки заготовок, ClustalX (см. Larkin et al. (2007) Clustal W
и Clustal X версии 2.0. Биоинформатика, 23: 2947 -2948). И BLAST, и FASTA доступны для офлайн и онлайн.
поиск (см. Ausubel et al, 1999, там же, страницы с 7 -58 по 7 -60). Однако для некоторых приложений предпочтительнее
использовать Ит -программа GCG Bestf. Новый инструмент под названием BLAST 2
Последовательности также доступны для сравнения белков и нуклеотидная последовательность (см. FEMS Microbiol Lett
1999 174 (2): 247 -50; FEMS Microbiol Lett 1999 177 (1): 187 -8 и
tatiana@ncbi.nlm.nih.gov) . Последовательность может иметь одну или несколько делеций, вставок
или замены аминокислотных остатков, которые производят бесшумное изменение и в результате функционально
эквивалентн ая моль экула. Умышленные замены аминокислот могут быть произведены на
на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидро фобичность, гидрофильность и / или амфипатическая
природа остатки до тех пор, пока сохраняется активность. Например,
отрицате льно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глютаминовая кислота; положительно заряженные
аминокислоты включают лизин и аргинин; и аминокислоты с незаряженной полярной
головкой группы, имеющие аналогичные значения гидрофильности,
включают лейцин,
изолейцин, валин, глицин, аланин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, фенилаланин и тирозин.
Могут быть сделаны консервативные замены, например в соответствии с таблицей ниже. Аминокислоты в одном блоке во втором столбце и желательно в той же стр оке в
третий столбец можно заменять друг на друга: АЛИФАТИЧЕСКИЙ
Неполярный GAP
РКН Полярно -незаряженный CS T M N Q
Полярно -заряженный D E
KR АРОМАТИЧЕСКИЙ H FW Y
Коронавирус по настоящему изобретению может включать вариантный ген репликазы, кодирующий белок,
предполагает мутацию по сравнению с любой из SEQ ID NO: 6, 7,
8 или 9, которые, когда выражаются в коронавирусе, вызывают вирус имеет пониженную патогенность по сравнению с короной
вирус, экспрессирующий соответствующую репликазу дикого типа.
Вариан т гена репликазы может кодировать белок, который содержит по меньшей мере одну или несколько
аминокислотных мутаций в любом комбинация nsp -10, nsp -14, nsp -15 и nsp -16. Вариант гена репликазы коронавируса
настоящее изобретение может кодировать белок, содерж ащий мута
как определено в последовательностях модов M41, представленных на фиг. 10. Вариант гена репликазы коронавируса настоящее изобретение может кодировать белок, который
включает одна или несколько аминокислотных мутаций, выбранных из списка:
Pro к Le u в положении 85 SEQ ID NO: 6, Vai к Leu в положении 393 SEQ ID NO: 7;
Leu к He в положении 183 SEQ ID NO: 8; Vai к He в положении 209 SEQ ID NO: 9. Вариант гена репликазы коронавируса
настоящее изобретение может кодировать белок, который не содержат мутацию в nsp -2, nsp -3, nsp -6 или nsp -13.
Вариант гена репликазы коронавируса настоящее изобретение может кодировать белок, который не
содержат мутацию в nsp 10, которая соответствует мутация треонина в изолейцин, вызванная мутацией в положение нуклеотида 12,008 в гене, о котором сообщил
Ammay - appan et al. (Arch Virol (2009) 154: 495 -499).
Ammayappan et al (как указано выше) сообщают об идентификации
изменения последовательности, ответственные за ослабление IBV штамм Arkansas DPI. В ходе исследования было выявлено 17
аминокислот. изменения ряда белков IBV после нескольких
переходы, ок. 100 вируса в зародышевых яйцах. Это Не исследовалось, был ли аттенуированный вирус (Ark DPI
101) способен воспроизводиться в присутствии материнского полученные антитела прот ив вируса in ovo, не будучи патогенны для эмбриона. Учитывая, что этот вирус был про
вызванный множественным пассажем в яйцах с SPF - эмбрионом, аналогичный
методологии классических вакцин против ИБК, вполне вероятно, что это вирус патогенен для эмбрионов. Вирус также может быть
чувствительны к материнским антителам, если куры были вакцинированы аналогичным серотипом.

22

Вариант гена репликазы коронавируса настоящее изобретение может кодировать белок, который
включает любая комбинация одной или нескольких аминок ислотных мутаций
предоставлено в списке выше. Вариант гена репликазы может кодировать белок, который
содержит аминокислотную мутацию Pro в Leu в положении 85 SEQ ID NO: 6.
Вариант гена репликазы может кодировать белок, который содержит аминокислотную мутацию Vai в Leu в положении 393 из SEQ ID NO: 7.
Вариант гена репликазы может кодировать белок, который содержит аминокислотную мутацию Leu в He в положении
183 SEQ ID NO: 8. Вариант гена репликазы может кодировать белок, который
содержит аминокислотную мутацию Vai в He в положении 209 SEQ ID NO: 9.

Стр.38
США 10 130 701 B2
41 год Вариант гена репликазы может кодировать белок, который содержит аминокислотные мутации от Pro до Leu в
положении 85 из SEQ ID NO: 6 и от Vai до Leu в положении 393 SEQ ID NO: 7.
Вариант гена репликазы может кодировать белок, который содержит аминокислотные мутации от Pro до Leu в
положении 85 из SEQ ID NO: 6 Leu к He в положении 183 SEQ ID
НЕТ: 8. Вариант гена репликазы может кодировать белок, который содержит аминокислотные м утации от Pro до Leu в
положении 85 из SEQ ID NO: 6 и Vai к He в положении 209 SEQ
ID NO: 9. Вариант гена репликазы может кодировать белок, который содержит аминокислотные мутации от Vai до Leu в
положении 393 из SEQ ID NO: 7 и Leu к He в положении 183 SEQ
ID NO: 8. Вариант гена репликазы может кодировать белок, который
содержит аминокислотные мутации от Vai до Leu в положении 393 SEQ ID NO: 7 и Vai к He в положении 209 SEQ
ID NO: 9. Вариант гена репликазы может кодировать белок, который
содержит аминокисло тные мутации Leu в He в положении 183 из SEQ ID NO: 8 и Vai к He в положении 209 SEQ
ID NO: 9. Вариант гена репликазы может кодировать белок, который содержит аминокислотные мутации от Pro до Leu в
положении 85 из SEQ ID NO: 6, от Vai к Leu в положении 393 SEQ ID
NO: 7 и Leu к He в положении 183 SEQ ID NO: 8. Вариант гена репликазы может кодировать белок, который содержит аминокислотные мутации от Pro до Leu в
положении 85 из SEQ ID NO: 6 Leu к He в положении 183 SEQ ID
NO: 8 и Vai к He в положении 209 SEQ ID NO: 9. Вариант гена репликазы может кодировать белок, который
содержит аминокислотные мутации от Pro до Leu в положении 85 из SEQ ID NO: 6, от Vai к Leu в положении 393 SEQ ID
NO: 7 и Vai к He в положении 209 SEQ ID NO: 9. Вариант гена репликазы может к одировать белок, который
содержит аминокислотные мутации от Vai до Leu в положении
393 из SEQ ID NO: 7, Leu на He в положении 183 SEQ ID NO: 8 и Vai к He в положении 209 SEQ ID NO: 9. Вариант гена репликазы может кодировать белок, который
содержит аминокис лотные мутации от Pro до Leu в положении
85 из SEQ ID NO: 6, от Vai к Leu в положении 393 SEQ ID NO: 7, от Leu к He в положении 183 SEQ ID NO: 8 и Vai к He в положении 209 SEQ ID NO: 9.
Вариантный ген репликазы также может быть определен в уровень нуклеоти дов.
Например, нуклеотидная последовательность варианта rep ген ликазы коронавируса по настоящему изобретению может
содержат одну или несколько нуклеотидных замен внутри регионы выбраны из списка: 11884 -12318, 16938 18500, 18501 -19514 и 19515 -20423 SEQ ID NO: 1.
Например, нуклеотидная последовательность варианта rep ген ликазы коронавируса по настоящему изобретению может
содержат одну или несколько нуклеотидных замен, выбранных из список:
Нуклеотид C относительно Tat в положении 12137; От G до C в положении нуклеотида 18114;
Т к А в положении нуклеотида 19047; и G к A в нуклеотидном положении 20139;
по сравнению с последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 1. Используемый здесь термин «замещение» является
синонимом. с термином мутация и означает, что нуклеотид на
идентифицированное положение отличается от положения нуклеотида дикого типа
последовательность. Нуклеотидная последовательность может включать любую комбинацию
нуклеотидных замен, выбранных из списка: 42 Нуклеотид C относительно Tat в положен ии 12137;
G в положении нуклеотида Cat 18114; Т к А в положении нуклеотида 19047; и
G к A в нуклеотидном положении 20139; по сравнению с последовательностью, представленной как
SEQ ID NO: 1. Нуклеотидная последовательность может содержать замену C12137T.
Нуклеотидная последовательность может содержать замену G18114C.
Нуклеотидная последовательность может содержать замену T19047A. Нуклеотидная последовательность может содержать замену
G20139A. Нуклеотидная последовательность может содержать замены
C12137T и G18114C. Нуклеотидная последовательность может содержать замены
C12137T и T19047A. Нуклеотидная последовательность может содержать замены C12137T и G20139A.
Нуклеотидная последовательность может содержать замены G18114C и T19047A.
Нуклеотидная последовательность может содержать замены G18114C и G20139A.
Нуклеотидная последовательность может содержать замены T19047A и G20139A. Нуклеотидная последовательность может содержать замены
C12137T, G18114C и T19047A. Нуклеотидная последовательность может содержать замены
C12137T, T19047A и G20139A. Нуклеотидная последовательность может содержать замены
C12137T, G18114C и G20139A. Нуклеотидная последовательность может содержать замены G18114C, T19047A и G20139A.
Нуклеотидная последовательность может содержа ть замены C12137T, G18114C, T19047A и G20139A.
Нуклеотидная последовательность может не содержать замены что соответствует замене C12008T, о которой сообщает
Ammayappan et al. (как указано выше).

23

Нуклеотидная последовательность может быть природной, синтет ической или
рекомбинантный. Он может быть двухцепочечным или одноцепочечным, может быть ДНК или РНК или их комбинации. Это может, например,
быть кДНК, продуктом ПЦР, геномной последовательностью или мРНК.
Нуклеотидная последовательность может быть оптимизи рована для кодонов
продуцирование в выбранной клетке -хозяине / хозяине. Он может быть изолированным или как часть плазмиды, вируса или хозяина.
ячейка. Плазмида
Плазмида - это внехромосомная молекула ДНК. скорость хромосомной ДНК, которая способна репликация независимо от хромосомной ДНК. Oни
обычно бывают круглыми и двухцепочечными. Плазмиды или векторы (как их иногда называют) могут
использоваться для экспрессии белка в клетке - хозяине. Например,
бактериальная клетка -хозяин может быть трансфицирова на плазмидой, способной кодирования определенного белка, чтобы выразить это
белок. Термин также включает искусственные хромосомы дрожжей.
и бактериальные искусственные хромосомы, которые способны
размещение более длинных участков ДНК. Плазмида по настоящем у изобретению содержит нуклео последовательность прилива, способная кодировать
определенную область белок репликазы. Он также может содержать одну или
несколько дополнительных стандартная нуклеотидная последовательность (ы) коронавируса или нуклеотид
после довательность (ы), способная кодировать одну или несколько других корон
вирусные белки, такие как ген S и / или ген 3. Плазмида может также содержать маркер устойчивости, такой
как как ген гуанин -ксантинфосфорибозилтрансферазы (gpt) из Escherichia coli, который придает устойчивость к

Стр. 39
США 10 130 701 B2
43 микофеноловая кислота (MPA) в присутствии ксантина и гипоксантин и контролируется вирусом осповакцины P7.5
ранний / поздний промоутер. Рекомбинантный вирус осповакцины
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным вакцинам. вирус цинии (rVV), содержащий вариантный ген репликазы,
как определено здесь.
Рекомбинантный вирус осповакцины (rW) можно получить с использованием система обратной генетики на основе вируса осповакцины.
В этом отношен ии настоящее изобретение также обеспечивает способ создания вирусной частицы:
(i) трансфекция плазмиды, как описано в предыдущем разделение на клетку -хозяина;
(ii) заражение клетки -хозяина рекомбинирующим вирусом содержащий геном штамма коронавируса с ген репликазы;
(привет) обеспечение гомологичной рекомбинации между последовательностями гена репликазы в плазмиде
и соответствующие последовательности в рекомбинирующем геном вируса для получения модифицированного гена
репликазы; (iv) отбор для рекомбинации вируса, содержащего модификацию
установленный ген репликазы.
Термин «модифицированный ген репликазы» относится к репликазе.
ген, который содержит вариантный ген репликазы, как описано в связи с первым аспектом настоящего изобретения.
В частности, термин от носится к гену, который происходит от ген репликазы дикого типа, но содержит нуклеотид
последовательность, которая заставляет его кодировать вариантную репликазу
белок, как определено здесь. Рекомбинация может включать всю или часть репликазы. ген. Наприме р, рекомбинация может включать нуклео
кодирование приливной последовательности для любой комбинации nsp -10,
НСП -14, НСП -15 и / или НСП -16. Рекомбинация может включают нуклеотидную последовательность, которая кодирует амино
кислотная мутация или включает ну клеотидную замену, как определено выше.
В геноме штамма коронавируса может отсутствовать часть белок репликазы, соответствующий части, представленной
плазмида, так что модифицированный белок образуется через вставка нуклеотидной последовательности, обеспеч иваемой плазмой
середина Рекомбинирующий вирус подходит для гомоло
gous рекомбинация между его геномом и плазмидой. Вирус осповакцины особенно подходит в качестве
гомологичного рекомбинация обычно используется для вставки и удаления последовательности для генома вируса осповакцины.
Вышеупомянутый метод необязательно включает шаг: (v) восстановление рекомбинантного коронавируса,
содержащего модифицированный ген репликазы из ДНК из рекомен связывание вируса со стадии (iv).
Методы восстановления рекомбинантного коронавируса, такие как
рекомбинантный IBV, известный в данной области (см. Britton et al.
(2005) см. Стр . 24; и PCT / GB2010 / 001293). Например, ДНК рекомбинирующего вируса из стадия (iv) может быть вставлена в плазмиду и использована
для трансфекции клетки, которые экспрессируют цитоплазматическую РНК -
полимеразу Т7. В клетки могут быть, например, предварительно
инфицированы вирусом оспы птиц. экспрессирующие РНК -полимеразу Т7. Рекомбинантный коронавирус
затем можно выделить, например, из питательной среды. Когда плазмида вставлена в вирус осповакцины
геном образуется нестабильный интермедиат. Рекомбинанты содержащую плазмиду, можно выбрать, например, для
использования маркер устойчивости на плазмиде. Положительные рекомбинанты затем м огут быть проверены
на наличие модифицированный ген репликазы, например, с помощью
ПЦР и секвенирования ing. 44 Большие запасы рекомбинирующего вируса, включая модифицированный ген репликазы (например,
рекомбинантный вирус осповакцины, (rW) можно выращиват ь и экстрагировать ДНК, чтобы выполнить шаг (v)).
Подходящие системы обратной генетики известны в данной области.
(Casais et al (2001) J. Virol 75: 12359 -12369; Casais et al. (2003) J. Virol. 77: 9084 -9089; Бриттон и др. (2005) Дж. Виро - Логические методы 123: 203 -211; Armesto et al (2008) Методы
in Molecular Biology 454: 255 -273). Ячейка

24

Коронавирус может использоваться для заражения клетки. Частицы коронавируса можно собирать, например, из
супернатант методами, известными в данной области, и необязательноочищенный. Клетка может быть использована для производства частицы
коронавируса. Таким образом, настоящее изобретение также предлагает
способ производящий коронавирус, который включает в себя
следующие шаги: (i) заражение клетки коронавирусом согласно
изобретение; (ii) позволяя вирусу реплицироваться в клетке; и
(привет) сбор потомства вируса. Настоящее изобретение также обеспечивает ячейку, способную
продуцировать коронавирус согласно изобретению с использованием
система обратной генетики. Нап ример, ячейка может содержать
геном рекомбинирующего вируса, содержащий нуклеотид последовательность, способная кодировать ген репликазы настоящее изобретение.
Клетка может производить рекомбинантную рекомбинирование
вирус (например, вирус осповакцины), со держащий ген репликазы.
В качестве альтернативы клетка может быть способна продуцировать реком binant coronavirus по системе обратной генетики. Клетка
может экспрессировать или быть индуцированным экспрессировать полимеразу Т7 в
чтобы спасти рекомбинантную вирусную частицу. Вакцина Коронавирус может быть использован для производства
вакцины. В вакцина может быть живой аттенуированной формой
коронавируса настоящего изобретения и может дополнительно включать
фармацевтическую Фактически приемлемый носитель. Как определено в данном документе, «фармацевтическая
приемлемые носители », подходящие для использования в изобретении.
д., хорошо известны специалистам в данной области. Такие перевозчики
включают, без ограничения, воду, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, фосфатный буфер, спиртовые / водные растворы, эмульсии
или подвески. Другие традиционно используемые разбавители и
вспомогательные вещества могут быть добавлены в соответствии с общепринятыми
техники. Такие носители м огут включать этанол, полиолы и подходящие их смеси, растительные масла и инъекционные органические эфиры. Буферы и агенты, регулирующие pH,
также могут быть заняты. Буферы включают, без ограничения, приготовленные
соли из органической кислоты или основани я. Типичные буферы включают,
без ограничения, соли органических кислот, такие как соли лимонной
кислоты, например цитраты, аскорбиновая кислота, глюконовая кислота, гистидин -
Хель, угольная кислота, винная кислота, янтарная кислота, уксусная кислота или фт алевая кислота, ирис, гидрохлорид триметанмина или фос
фатовые буферы. Парентеральные носители могут включать хлористый натрий.
раствор райда, декстроза Рингера, декстроза, трегалоза, сахароза и хлорид натрия, лактатные масла Рингера или
жирные масла.
Внут ривенные носители могут включать восполнение жидкости и питательных веществ.
промыватели, пополнители электролита, например на основе Декстроза Рингера и тому подобное. Консерванты и прочее добавки, такие как, например, противомикробные препараты,
антиокси данты, хелатирующие агенты (например, EDTA), инертные газы и
т.п. могут также поставляться в фармацевтических
носителях. Настоящее изобретение не ограничивается выбором носителя. В приготовление этих фармацевтически приемлемых
композиций элементы, из описанных выше компонентов, имеющие допуск
приатная изотоничность pH, стабильность и другие обычные

Стр. 40
США 10 130 701 B2
45 характеристики находятся в пределах компетенции специалистов в данной области техники. См., Например,
такие тексты как Ремингтон: Наука и практика фармации, 20 -е
изд ., Lippincott Williams & Wilkins, pub! .., 2000; и Справочник по фармацевтическим вспомогательным
веществам, 4 -е изд., Ред. Р. К. Роу и др., Публикации APhA, 2003 г. Вакцина по изобретению будет вводиться в “ т ерапевтически
эффективном количестве ” , которое относится к количеству активного ингредиента , например , агента согласно
изобретению , достаточному для достижения полезных или желаемых результатов при введении субъекту или пациенту .
Эффективное количест во может быть введено в одном или нескольких введениях или дозировках . Терапевтически эффективное количество композиции согласно изобретению
может быть легко определено обычным специалистом в данной области . В контексте настоящего изобретения
"терапевтич ески эффективное количество" - это такое количество , которое производит объективно измеренное изменение одного или нескольких параметров, связанных с
состоянием инфекционного бронхита. Достаточно для достижения положительных или желаемых
результатов. Эффе ктивный количество можно вводить за одно или несколько введений.
Для целей данного изобретения эффективное количество лекарственного средства, соединение или фармацевтическая композиция - это
количество Достаточно для снижения заболеваемости инфекционным
бронхитом. Используемый здесь термин «терапевтический» охватывает
все спектр лечения заболевания, состояния или расстройства. «Терапевтический» агент по изобретению может действовать
следующим образом: то есть профилактическое или профилактическое, в том числе
те, которые включать процедуры, разработанные для животных, которые могут
быть идентифицированным как группа риска (фармакогенетика); или в
способ, имеющий мелиоративный или лечебный характер; или может действовать
замедлить скорость или степень прог рессирования хотя бы одного симптом заболевания или расстройства, которое лечат.
Настоящее изобретение также относится к способу профессионального
создание такой вакцины, которая включает стадию заражения клетки, например клетки Vero, с вирусной частицей,
содержащей белок репликазы, как определено в связи с первым аспект изобретения.
Метод вакцинации

25

Коронавирус по настоящему изобретению можно использовать для
лечить и / или предотвращать заболевание. «Лечить» означает вводить вакцину субъекту. наличие суще ствующего заболевания с целью уменьшения,
уменьшения или улучшить хотя бы один симптом, связанный с заболеванием
и / или замедлить, уменьшить или заблокировать прогрессирование болезни .
«Предотвратить» означает ввести вакцину субъекту. кто еще не заразился болезнью и / или не болен показать какие -либо симптомы заболевания, чтобы
предотвратить или ослабить причину заболевания (например, инфекция) или уменьшить
или предотвратить развитие хотя бы одного симптома, связанного с болезнью. Это может быть любое заб олевание , вызванное
коронавирусом, например респираторное заболевание и / или гастроэнтерит.
люди и гепатит , гастроэнтерит , энцефалит или респираторное заболевание у других животных . Заболевание
может быть инфекционным бронхитом (ИБ); Свиной эпидемиче ская диарея; Трансмиссивный гастроэнтерит; Мышь
вирус гепатита; Гемагглютинирующие энцефаломиели свиней; Тяжелый острый респираторный синдром
(ОРВИ); или синий Расчесочная болезнь. Заболевание может быть инфекционным бронхитом.
Вакцину можно вводить вылупившимся цыплятам или цыплята, например, в виде глазных капель или интраназального введения
тион. Несмотря на точность, эти методы могут быть дорогими, например
для крупных бройлерных стад. Альтернативы включают спрей инокулят Введение в питьевую воду, но это может быть трудно
обеспечить единообразное применение вакцины такими методами.
46 Вакцина может быть предоставлена в форме, подходящей для введение, например, пипетка для внутриглазного
применения. Вакцину можно вводить путем инокуляции in ovo,
например, путем инъекции яиц с зародышем. В ово вакцинация имеет то преимущество, что она обеспечивает раннюю стадиюустойчивость к болезни. Это также облегчает
администрирование равномерной дозы для каждого субъекта, в отличие от инокуляции спреем и введен ие через питьевую
воду. Вакцина может быть введена любому подходящему человеку.
части яйца, включая аллантоисную жидкость, желточный мешок,амнион, воздушная клетка или эмбрион. Его можно вводить в оболочку (воздушная ячейка) мембрана и
хориоаллантоисная ме мбрана. Обычно вакцину вводят в яйца с эмбрионом.
на поздних стадиях эмбрионального развития, как правило в течение последней четверти инкубационного периода,
например, 3 -4дней до вылупления. Курам вакцину можно вводить с 15 -19 днями 21 -дневного инкубацион ного периода, например на 17 или 18 день.
Процесс м ожно автоматизировать с помощью роботизированного впрыска.
процесс, такой как описанный в WO 2004/078203. Вакцина может вводиться вместе с одним или
другие вакцины, например, вакцины от других болезней бол езни, такие как вирус болезни Ньюкасла (NDV). Настоящее изобретение также обеспечивает композицию вакцины,
содержащую вакцина согласно изобретению вместе с одним или несколькими
другая вакцина (и). Настоящее изобретение также предлагает набор включающие ва кцину по изобретению вместе
с одной или несколькими вакцинами для отдельной, последовательной или
одновременное введение. Вакцина или вакцинная композиция по изобретению может
использоваться для лечения ч еловека, животного или птицы. Например, субъектом может быть цыпленок, курица или мышь (например,
как лабораторная мышь, например трансгенная мышь). Как правило, врач или ветеринар определяет
фактическую дозировку , которая будет наиболее подходящей для человека
предмет или группа предметов, и это будет ме няться в зависимости от возраста, вес и ответ конкретного предмета (ов).
Композиция может необязательно включать аптечный приемлемый носитель, разбавитель, эксципиент или
адъювант. В выбор фармацевтического носителя, наполнителя или разбавителя может быть
выбран с учетом предполагаемого пути введения и стандартная фармацевтическая
практика. Фармацевтический композиции могут содержать в качестве (или в дополнение к)
носителя, наполнитель или разбавитель, любое подходящее связующее, смазывающее вещество (и),
суспендирующий агент (ы), покрывающий агент (ы), солюбилизирующий агент (ы),
и другие агенты -перевозчики, которые могут помочь или увеличить доставку
или иммуногенность вируса. Далее изобретение будет описано с помощью Примеры, которые призваны помочь одно му из обычных
навыки в данной области техники в реализации изобретения и не
предназначены каким -либо образом ограничивать объем изобретения. ПРИМЕРЫ
Пример 1 - Генерация обратного IBV Генетическая система на основе M41 -CK
Полноразмерную кДНК M41 -CK получал и путем замены кДНК Beaudette в реверсе вируса осповакцины
система генетики, описанная ранее в PCT / GB2010 / 001293 (включено сюда в качестве ссылки) с синтетическим кДНК, полученная из консенсусной последовательности M41.
КДНК IBV в рекомбинантном вирусе осповакцины (rW) Структура rW -BeauR -Rep -M41, описанная в Armesto,
Кавана и Бриттон (2009). PLoS ONE 4 (10): e7384. doi: 10.1371 / joumal.pone.0007384, который состоял из
репликаза, полученная из штамма IBV Beaudette, и структура

Стр. 41
США 10 130 701 B2
48 47 структурные и вспомогательные гены и 3 'UTR из IBV M41 -CK,
был дополнительно модифицирован заменой Beaudette 5 ' Последовательность UTR -Nsp2 -Nsp3 с соответствующей последовательностью
от IBV M41 -CK. Полученная кДНК IBV состояла из 5 'UTR -Nsp2 -Nsp3 от M41, Nsp4 -Nspl6 от Beaudette
и структурные и вспомогательные гены и 3 'UTR из M41. Эта кДНК была дополнительно модифицирована
удалением Последовательность Beaudette Nsp4 -Nspl6. Полученная кДНК, без Nsp4 -16, был изменен в четырех дальней ших этапах, в
которых удаленные Nsps последовательно заменялись на
соответствующие последовательности от M41 -CK, замена кДНК представлены M41 -CK Nsp4 -8, Nsp9 -12, Nspl2 -14 и
наконец Nspl5 -16. Каждая замещающая кДНК содержала ок. 500 нуклеотидов на 5 'конце, соответствующем 3'
большая часть последовательности M41 ранее вставлена и прибл. 500
нуклеотиды на 3' -конце, соответствующие гену M41 S

26

последовательность. Это позволило вставить кДНК M41. последовательность путем гомологичной рекомбинации и
последовате льной добавление непрерывной последовательности гена репликазы М41. В
синтетические кДНК, содержащие производный от M41 Nsp последовательности были добавлены с помощью
использования гомологичной рекомбинации. описанная ранее переходная доминанта изобретате ля
система отбора (IDS) (см. PCT / GB2010 / 001293). В КДНК, производные от M41, содержащие последовательность, соответствующую
M41 Nsps -10, -14, -15 и -16 содержали модифицированные аминокислоты в положениях 85, 393, 183 и 209 соответственно,
как показано на фиг. 10. Полноразмерная кДНК, представляющая геном M41 -CK был создан в вирусе осповакцины, представляющем
синтетический последовательности. Два rIBV, M41 -R-6 и M41 - R-12, были уничтожены.
показаны и показаны как растут аналогично M41 -CK (Фиг.1 ).
Пример 2 - Определение патогенности Спасенные вирусы M41
Вирусы, спасенные в примере 1, были использованы для
заражения
8-дневные цыплята, свободные от специфических патогенов (SPF), по глазным и
назальная инокуляция, чтобы проверить их на патогенность, как наблюдали
по клиническим признакам ежедневно через 3 -7 дней после заражения и
на 4 -й и 6 -й дни после инфицирования цилиарной активностью. Утрата цилиарная активность - хорошо зарекомендовавший себя
метод определения патогенность ИБК. Два вируса M41 -R б ыли
оказался апатогенным по сравнению с M41 -CK, хотя они действительно показали некоторые клинические
признаки по сравнению с обычными зараженных контрольных цыплят (рис. 2) и некоторых, но непостоянных потерь
цилиарной активности (фиг. 3). Таким образом, молекулярные клоны M41 -R M41 -CK не были
патогенный по сравнению с родительским вирусом M41 -CK. Авторы изобретения идентифицировали несколько нуклеотидных различий в
M41 -R по сравнению с последовательностями M41 - CK. Основным
это были синонимичные мутации, п оскольку нуклеотидный изменение не повлияло на аминокислотную
последовательность белка связанный с последовательностью. Однако четыре несиноничных -мутации мышей были выявлены в гене
репликазы IBVспецифичен для компонентов Nsp -10, Nsp -14, Nsp -15 и Nsp -16 гена репликазы эти м утации привели к
аминокислотнымизменениям (таблица 3). ТАБЛИЦА 3
Non -синонимичные мутации , выявленные в том NSPS из M41 - R полный leneth eenome
Регион Репликация
Нуклеотид должность
Нуклеотид Мутация Аминокислотное изменение
Nsp 10 12137
С- * Т Pro Лея
Nsp 14
18114 G ^ C
Val ^ Leu ТАБЛИЦА 3 (продолжение) 45
50 55
60 65
Несинонимичные мутации, выявленные в Nsps M41 -R полный leneth eenome Регион из
Репликация Нуклеотид
должность Нуклеотид Мутация
Аминокислотное изменение Nsp 15
19047 Т ^ А
Leu ^ Ile Nsp 16 20139
G ^ A Вал ^ Иль
Пример 3 - Ремонт rIBV M41 -R Чтобы определить, есть ли выявленные мутации
были ответственны за потерю патогенности, связанной с с M41 -R мутация Nsp 10 была исправлена и мутации в Nsp -14, -15 и -16 были исправлены и показали, что
растут аналогично M41 -CK (фиг. 9). Изобретенный Таким образом, торс генерировал rIBV, M41R -nspl0rep и M41R -
nspl4, 15, 16rep, используя синтетические кДНК, содержащие правильные нуклеотиды, используя предыдущие описанная (TDS) система (см. PC T / GB2010 / 001293).
RIBV оценивали на патогенность у цыплят следующим образом:
описано ранее. Оба rIBV показали повышенную патогенность. гениальность по сравнению с M41 -R, но не до уровня
наблюдали с M41 -CK (фиг. 4 и 5). М41Р -НСПЛ4, 15, 16rep дал больше клинических признаков и большее уменьшение цилиарной
активности, чем M41R -nspl0rep, в целом эти результаты показали
что изменения, связанные с четырьмя Nsps, кажутся влияют на патогенность.
Чтобы определить роль Nsps в патогенности, полноразмерная кДНК, со ответствующая M41R -nspl0rep, была используется для восстановления мутаций в Nspsl4, 15 и 16 с
использованием синтетическая кДНК, содержащая правильные нуклеотиды с
использованием система TDS.
Были произведены следующие rIBV: M41R -nsplO, 15rep — M41 -R с мутациями в Nsp - 10 и Нсп -15 отремонтированы
M41R -nsplO, 14, 15rep — M41 -R с мутациями в Nsp - 10, -14 и -15 отремонтированы
M41R -nsplO, 14, 16rep — M41 -R с мутациями в Nsp - 10, -14 и -16 отремонтированы M41R -nsplO, 15, 16rep — M41 -R с мутациями в Nsp -
10, -15 и -16 отремонтированы M41 -K - все четыре мутации, Nsp -10, -14, -15 и -16
отремонтирован в М41 -Р Было показано, что rIBV растут таким же образом, как и
M41 -CK (фиг. 9) и оцененная на патогенность как описано ранее. M41 -K (в котором все четыре мутации бы л отремонтирован) привел к клиническим признакам и
100% потереактивности ресничек (полный цилиостаз) через 4 дня после инфекции (фиг. 6, 7 и 8). Остальные rIBV
продемонстрировали различные уровни патогенности, кроме M41R -nspl0,15,
16rep, который был по сущ еству апатогенным. Эти результаты

27

подтвердили, что восстановление всех четырех Nsps восстановило патогенность
к M41 -R; снова подтверждая предыдущие доказательства того, что мутации, описанные в четырех Nsps, участвуют в
ослабляющий М41 -СК. Авторы изобретен ия также создали rIBV M41R -nsp 10, 14 rep.
(nsp 10 и 14 восстанавливаются, nsp 15 и 16 содержат мута ции) и rIBV M41R -nsp 10, 16 rep (nsp 10 и 16 являются
восстановлены, nsp 14 и 15 содержат мутации) и оценили патогенность этих вирусов. rIBV M41R -nsp 10,14 менее патогенен, чем M41 -K
но вызывал около 50% цилиостаза на 4 -6 день после инфицирования.
тион. rIBV M41 R -nsp 10, 16 rep был почти апатогенным и не вызывал цилиостаза (см. фиг.1a -c).

Стр. 42
США 10 130 701 B2 49 50 Таким образом, геном, связанный с M41 -R, является потенциальным скелетный геном рационально ослабленного ИБК.
Пример 4 - Исследование вакцинации / заражения M41 -R
Вирусы -кандидаты для вакцины были протестированы в исследованиях, в которых
оплодотворенные куриные яйца вакцинировали in ovo ч ерез 18 дней. эмбрионация и при которой выводимость инокулированного
яйца были определены. Клиническое здоровье кур было io исследовали, и цыплят заражали через 21 день
возраст с вирулентным контрольным вирусом IB M41 в 103'65 EID50
на дозу. Клинические признаки исследовали после защиты от заражения.
вакциной и тест на цилиостаз проводили через 5 дней 15 после вызова, чтобы исследовать эффект вызова
вирусов на движение ресничек и защиту вакцина против цилиостаза (подавление движения ресничек). Вакцинация in Ovo в коммерческих яйцах бройлеров
План эксперимента приведен в таблице 4 и 20 клинические результаты представлены в таблице 5.
Выводимость яиц. инокулированный IB M41 -R был хорош, и цыплята были
здоровый. IB M41 -R защищен от клинических признаков после проблема у бройлеров (плацебо: поражено 19/19, IB M41 - R: 3/18 пострадавших и 1 мертвый). Результаты цилиостаза 25
Испытания приведены в Таблице 6. Защита, генерируемая IB M41 -R
против цилиостаза. Результаты по ciliostasis теста после
заражения, для проек тирования см Таблица 1. ТАБЛИЦА 6 лечение
Защищено / всего Процентная защита
Физиологический раствор 0/19
0% IB M41R 5/18
28% Вакцинация in Ovo в яйцах, свободных от определенных
патогенов (SPF) Дизайн исследования яиц SPF представлен в таблице 7. и аналогичен дизайну исследований с коммерческими
бройлеров, но доза вакцины против ИБ M41 -R была выше, (10 с EID50 на дозу).
Результаты (Таблица 8) показывают, что процент вывода для Люк IB M41 -R был низким, вылупилось 19 из 40 и
птенцы были слабыми. Погибл и восемь птенцов. Остальные 11
цыплят были заражены, и 11 цыплят вылупились из яйца, зараженные физиологическим раствором, были одолжил.
В тесте на цилиостаз после заражения оказалось, что все цыплята, вакцинированные in ovo ИБ M41 -R, были
защищены, тогда как ни один из элементов управления не был защищен,
см. Таблицу 9. Конструкция из более выводимости, безопасности, эффективность исследования в коммерческих яйцах
ТАБЛИЦА 4 ид 50 '
Маршрут День (дни) День (дни)
Конец № из
лечение на
из яйца на Описание леч ения
доза Админ
Админ Вызов 2
Исследование лечение T01
Никто NA
NA NA NA
NA 30
T02 IB M41 -R
10 4 В ово 18 дней
В 21 день В 26 лет
30 NTX
Физиологический раствор NA В ово
эмбрион от 20 лет
дней нация
куры в возрасте на группу
J Объем дозы 0,1 мл, нет данных , не применимо. 21 кв 3.65 £ [ д 50 р э дозы.
Процент вывода и клинические данные до и после Проблема в коммерческих кур, для проектирования см Таблица 1.
ТАБЛИЦА 5 Люк /
лечение Всего
До После _______ вызов _____ _________ вызов _________
Жизненно необходимо/ Летальные исходы/
Симптомы / Смерти / Симптомы /
Всего

28

Всего Всего
Всего Всего Никто
28/30 IB M41 -R
28/30 Физиологический раствор
29/30 Эвтаназия сразу после вывода для забора крови 28/28
1/20 0/19
1/19 3/18 1 - 7 29/29
1/20 0/19
0/19 19 / 191 -2 - 3-4-5-6-7
нарушение дыхательной системы 2 свист ^ Изменение голоса
4 затрудненное дыхание 5 опухшие внутриглазничные пазухи
^ Неравномерный рост 7Слабый
Стр. 43
США 10 130 701 B2 51 52 ТАБЛИЦА 7 Дизайн исследования выводимости, безопасности и
эффективности яиц с SPF лечение лечение
Описание EID jo 1
на доза Маршрут
из Админ
День из
Админ День из
Challenge2 Конец
из Исследование
№ из яйца на лечение
T01 IB M41 -R
105 В ово
18 дней В 21 день В 26 лет
40 эмбрион
возраста дней T04
Физиологический раствор NA
В ово нация
возраста
40 NTX
NA NA NA
NA 10
J Объем дозы 0,1 мл, нет данных , не применимо. Вызов дозы 10 3 ' 3 ELD5Q в 0,2 мл.
ТАБЛИЦА 8 Процент вывода и клинические данные до и после у цыплят SPF, дизайн см. в Таблице 7.
лечение Люк /
Всего Жизненно необходимо/ Всего
До вызов
После вызов
Летальные исходы/ Всего Симптомы /
Всего Летальные исходы/
Всего Симптомы /
Всего IB M41 -R 19/40
11/40 8/40
слабый 0 0
Физиологический раствор 30/40
30/40 0
- 0 0
NA 9/10
9/10 0
- - -
ТАБЛИЦА 9 Результаты теста на цилиостаз после заражения, дизайн см. В
таблице 7. Лечение Защищено / всего
Процентная защита Физиологический раствор 0/11
0% IB M41R
11/11 100% 35 год
В заключение, IB M41 -R был безопасен в коммерческих яйцах, обеспечивает защиту от клинических признаков и в
определенной степени против цилиостаза.
40 В яйцах SPF, вакцинированных IB M41 R, относительно низкий
количество вылупившихся цыплят. Это может быть связано с 105
EID50 на яйцо использованного IB M41 -R. Это было в 10 раз больше

29

чем доза, испо льзованная в более ранних исследованиях, в которых
более высокий уровень выводимости. Более низкий процент вывода также может быть вызвано особенно высокой
восприимчивостью партия яиц SPF на вирусы, как и в других исследованиях
уровень смертности эмбрионов также была выше, чем ранее
наблюдалось. После заражения все выжившие цыплята после вывода были полностью защищен от цилиостаза. Сделан вывод, что
IB M41 -R имеет большой потенциал в качестве вакцины для введения
Все публикации, упомянутые в приведенной выш е спецификации, сюда включен ы в качестве ссылки. Различные модификации и
варианты описанных методов и системы изобретение будет очевидно специалистам в данной области
отступая от объема и сущности изобретения. Хотя изобретение было описано в связи с
с ко нкретными предпочтительными вариантами осуществления он должен быть ниже постановил, что заявленное изобретение не должно быть
необоснованноограничивается такими конкретными вариантами осуществления. Действительно, различные
модификации варианты описанных режимов для выполнения изобретенных
которые очевидны для специалистов в области молекулярной биологии, вирусология или связанные области должны входить в сферу
из следующих утверждений. СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<160> НОМЕР SEQ ID NO : 13 <400> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 1 <210> SEQ ID NO 1
<211> ДЛИНА: 27500 <212> ТИП: ДНК
<213> ОРГАНИЗМ: Вирус инфекционного бронхита

Стр.44
Стр.45

Стр. 46

Стр. 47
Стр. 48

Стр. 49

Стр.50
Стр. 51

Стр.52

Стр. 53

Стр.54

Стр.55
<210> SEQ ID NO 2
<211> ДЛИНА: 435 <212> ТИП: ДНК
<213> ОРГАНИЗМ: Инфекционный <400> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 2
tctaaaggtc atgagacaga ggaagtggat
gcagtagatc ctgcggatac atattgtaaa aactgtgtta aaatgttgac agtacataat
agtccaactc cggatcagga ttcttatgga catatagcac accttggcgg agcaggaaat tttgtgcaaa tacctactac ggagaaagat
tgcactgttt gtcagtgttg gattggttat aaaccttctg ttcag
вирус бронхита <210> SEQ ID NO 3
<211> ДЛИНА: 1563 <212> ТИП: ДНК <213> ОРГАНИЗМ: вирус инфекционного бронхита.
400 ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 3
Стр.56
<210> SEQ ID NO 4 <211> ДЛИНА: 1014
<212> ТИП: ДНК <213> ОРГАНИЗМ: вирус инфекционного бронхита.
<400> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 4

Стр.57
США 10 130 701 B2
79 80 -продолженный
gattctgatg tcatgcaaaa ttattttgta ttggcagaca atggttccta caagcaagtg
840 tgtactgttg tggatttgct gcttgatgat ttcttagaac ttcttaggaa catactgaaa
900 gagtatggta
ctaataagtc taaagttgta acagtgtcaa ttgattacca tagcataaat 960 tttatgactt
ggtttgaaga tggcattatt aaaacatgtt atccacagct tcaa 1014
< 210> SEQ ID NO 5 < 211> ДЛИНА: 909
< 212> ТИП: ДНК < 213> ОР ГАНИЗМ: Вирус инфекционного бронхита gaaccttgca
acattcctaa ttatggtgtt ggaatagcgt tgccaagtgg tattatgatg 120
aatgtggcaa agtatacaca actctgtcaa tacctttcga aaacaacaat gtgtgtaccg
180 cataatatgc gagtaatgca ttttggagct ggaagtgaca aaggagtggt gccaggtagt
240 actgttctt a
aacaatggct cccagaaggg acactccttg tcgataatga tattgtagac 300 tatgtgtctg
atgcacatgt ttctgtgctt tcagattgca ataaatataa gacagagcac 360
aagtttgatc ttgtgatatc tgatatgtat acagacaatg attcaaaaag aaagcatgaa
420 ggcgtgatag ccaataatgg caatgatgac gttttcatat atctctcaag ttttcttcgt
480 aataatttgg
ctctaggtgg tagttttgct gtaaaagtga cagagacaag ttggcacgaa 540
gttttatatg acattgcaca ggattgtgca tggtggacaa tgttttgtac agcagtgaat 600
gcctcttctt cagaagcatt cttgattggt gttaattatt tgggtgcaag tgaaaaggtt
660 aaggttagtg

30

gaaaaacgc t gcacgcaaat tatatatttt ggaggaattg taattattta 720
caaacctctg cttatagtat atttgacgtt gctaagtttg atttgagatt gaaagcaacg 780
ccagttgtta atttgaaaac tgaacaaaag acagacttag tctttaattt aattaagtgt
840 ggtaagttac
tggtaagaga tgttggtaac acctctttta ctagtgactc ttttgtgtgt 900 actatgtag
909 < 210> SEQ ID NO 6
< 211> ДЛИНА: 145 < 212> ТИП: PRT < 213> ОРГАНИЗМ: Вирус инфекционного бронхита
< 400> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 6 Ser Lys Gly His Glu Thr Glu Glu Vai Asp Ala Vai Gly He Leu Ser
< 400> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ : 5
Tcagcatgga cgtgtggtta taatatgcct gaactttata aagttcagaa ttgtgttatg 60

Стр.58
США 10 130 701 B2
81 год 82 -продолженный 115
120 125
Gly Tyr Gly Cys Gin Cys Asp Ser Leu Arg Gin Pro Lys Pro Ser Vai 130
135 140 Джин
145 < 210> SEQ ID NO 7
< 211> ДЛИНА: 521 < 212> ТИП: PRT < 213> ОРГАНИЗМ: Вирус инфекционного бронхита
< 400> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ : 7 Gly Thr Gly Leu Phe Lys lie Cys Asn Lys Glu Phe Ser Gly Vai His
15 10
15 Pro Ala Tyr Ala Vai Thr Thr Lys Ala Leu Ala Ala Thr Tyr Lys Vai 20
25 30
Asn Asp Glu Leu Ala Ala Leu Vai Asn Vai Glu Ala Gly Ser Glu lie 35 год
40 45 Thr Tyr Lys His Leu lie Ser Leu Leu Gly Phe Lys Met Ser Vai Asn
50 55
60 Вай Глу
Gly Cys His Asn Met Phe He Thr Arg Asp Glu Ala He Arg 65
70 75
80 Асн Вай Arg Gly Trp Vai Gly Phe Asp Vai Glu Ala Thr His Ala
Cys 85
90 95
Gly Thr Asn He Gly Thr Asn Leu Pro Phe Gin Vai Gly Phe Ser Thr
100 105
110 Gly Ala Asp Phe Vai Vai Thr Pro Glu Gly Leu Vai Asp Thr Ser He 115
120 125
Gly Asn Asn Phe Glu Pro Vai Asn Ser Lys Ala Pro Pro Gly Glu Gin 130
135 140 Phe Asn
Его Leu Arg Ala Leu Phe Lys Ser Ala Lys Pro Trp His Вай
145 150 155
160 Vai Arg Pro Arg He Vai Gin Met Leu Ala Asp Asn Leu Cys
Asn Vai 165
170 175 Ser Asp Cys Vai Vai Phe Vai Thr Trp Cys His Gly Leu Glu Leu Thr
180 185
190 Thr Leu Arg Tyr Phe Vai Lys He Gly Lys Asp Gi n Vai Cys Ser Cys
195 200 205
Gly Ser Arg Ala Thr Thr Phe Asn Ser His Thr Gin Ala Tyr Ala Cys 210
215 220 Trp Lys
Его Cys Leu Gly Phe Asp Phe Vai Tyr Asn Pro Leu Leu Vai
225 230
235 240 Asp He Gin Gin Trp Gly Tyr Ser Gly Asn Leu Gin Phe Asn His
Жерех 245
250 255
Leu His Cys Asn Vai His Gly His Ala His Vai Ala Ser Ala Asp Ala 260 265
270 Он встретил Thr Arg Cys Leu Ala He Asn Asn Ala Phe Cys Gin
Asp Vai 275
280 285 Asn Trp Asp Leu Thr Tyr Pro His He Ala Asn Glu Asp
Glu Vai Asn 290
295 300 Сер Сис Арг Тир Лей Гин Арг Мет Тир Лей Асн Ала Цис Вай
Асп 305
310 315
320

Стр.59

Стр. 60

Стр.61

31


Стр.62

Стр.63

Стр.64
Заявленное изобретение: 60
1. Живой аттенуированный коронавирус, содержащий вариант ген репликазы, кодирующий полипротеины, содержащие
мутацию в одном или обоих неструктурных белках nsp -10 и
nsp -14, где вариантный ген репликазы кодирует белок содержащий аминокислотную мутацию Pro в Leu на 65
положение, соответствующее положению 85 SEQ ID NO: 6, и / или где вариантный ген репликазы кодируе т белок содержащий аминокислотную мутацию Vai в Leu на
положение, соответствующее положению 393 SEQ ID NO: 7. 2. коронавируса по п 1 , в котором
вариантный ген репликазы кодирует белок, содержащий один или
больше аминокислотных мутаций, выбранных из: амино кислотная мутация Leu в He в положении соответствует положению 183 SEQ ID NO: 8; и

Стр.65
США 10 130 701 B2
95 аминокислотная мутация Vai в He в положении соответствующий положению 209 SEQ ID NO: 9.
3. Коронавирус по п.1, в котором ген репликазы кодирует белок, содержащий аминокислоту мутации Vai в Leu в положении, соответствующем
положение 393 SEQ ID NO: 7; Leu to He на позиции соответствует положению 183 SEQ ID NO: 8; и Вай к
Он в положении, соответствующем позиции 209 SEQ ID НЕТ: 9.
4. Коронави рус по п.1, в котором ген репликазы кодирует белок, содержащий аминокислоту мутации Pro в Leu в позиции, соответствующей
положение 85 SEQ ID NO: 6; Вай к Леу в позиции соответствующий положению 393 SEQ ID NO: 7; Лей к он
в положении, соответствующем положе нию 183 SEQ ID NO: 8; и Вай Хэ в позиции, соответствующей позиции 209
SEQ ID NO: 9. 5. Коронавирус по п.1, в котором ген репликазы содержит по крайней мере один нуклеотидный
заместитель выбрано из:
Нуклеотид C относительно Tat в положении 12137; и От G до C в положении нуклеотида 18114; по сравнению с последовательностью, представленной как
SEQ ID NO: 1; и необязательно содержит один или несколько нуклеотидных
заместителей. выборки, выбранные от Т до А в нуклеотидном положении
19047; и G к A в нуклеотидном положении 20139; по сравнению с последовательностью, представленной как
SEQ ID NO: 1. 6. Коронавирус по п.1, который является
вирус инфекционного бронхита (IBV). 7. Коронавирус по п.1, который представляет собой IBV.
M41. 8. Коронавирус по п.7, который включает по крайней мере, S -белок, часть которого относится к
серотипу IBV кроме M41.
9. Коронавирус по п.8, в котором SI субъединица относится к серотипу IBV, отличному от M41.
10. Коронавирус по п.8, в котором S белок принадлежит к серотипу ИБК, отличном у от M41.
11. Коронавирус по п.1, имеющий сниженная патогенность по сравнению с коронавирусом,
экспрессирующим соответствующая репликаза дикого типа, где вирус представляет собой
способны к репликации, не будучи патогенными для эмбрион при введении в яйцо с зародышем.
96 12. Вариант гена репликазы по п.1. 13. Белок, кодируемый вариантной репликазой коронавируса.
ген по п.12. 14. Плазмида, содержащая ген репликазы по п.
п.12. 15. Способ получения коронавируса по п.1, который включает следующие этапы:
(i) тра нсфекция плазмиды по п. 14 в хозяина ячейка;
(ii) заражение клетки -хозяина рекомбинирующим вирусом содержащий геном штамма коронавируса с ген репликазы;
(iii) обеспечение гомологичной рекомбинации между последовательностями гена репликазы в плазмиде
и соответствующие последовательности в рекомбинирующем геном вируса для получения модифицированного гена
репликазы; и (iv) отбор для рекомбинации вируса, содержащего модификацию
установленный ген репликазы. 16. Способ по п.15, в котором
рекомбинирующий вирус представляет собой вирус осповакцины.
17. Способ по п.15, который также включает Шаг: (v) восстановление рекомбинантного коронавируса,
содержащего модифицированный ген репликазы из ДНК из рекомен
связывание вируса со стадии (iv). 18. Клетка, способная про дуцировать коронавирус, согласно
к претензии 1. 19. Вакцина, содержащая коронавирус, согласно п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
20. Способ лечения и / или профилактики заболевания в субъект, который включает стадию введения
вакцина по п.19 для суб ъекта. 21. Способ по п.20, в котором заболевание представляет собой инфекционный бронхит (ИБ).
22. Способ по п.20, в котором способ введения выбран из группы, состоящей из;
введение глазных капель, интраназальное введение, питье введение воды, инъекция пос ле вылупления и in ovo injec
тион. 23. Способ по п.21, в котором администратор проводится вакцинация in ovo.
24. Способ получения вакцины по пп. 19, который включает этап заражения клетки в соответствии с
п.18 с коронавирусом по п.1. 25. Коронавирус по п.1, далее ком.
выявление мутации в одном или обоих из nsp -15 и nsp -16
X