микроскоп. центрифугирование.

Формат документа: docx
Размер документа: 0.02 Мб




Прямая ссылка будет доступна
примерно через: 45 сек.




Теги: ТГУ
  • Сообщить о нарушении / Abuse
    Все документы на сайте взяты из открытых источников, которые размещаются пользователями. Приносим свои глубочайшие извинения, если Ваш документ был опубликован без Вашего на то согласия.


Центрифугирование Может отдельных частиц и молекул, которые отличаются в массе или плотности
Первым шагом в типичной схеме белок-очистка центрифугированием. Принцип, лежащий в центрифугированием в том, что две частицы в суспензии (клетки, органеллы, или молекул), имеющие различные массы или плотности будет оседать на дно трубки с различной скоростью. Напомним, масса вес образца (в граммах), в то время как плотность отношение его массы к объему (г / л). Белки в значительной степени в массе, но не изменяются по плотности. Средняя плотность белка, 1,37 г / см 3. Если белок не имеет прикрепленную липида или углеводов, ее плотность не будет изменяться более чем на 15 процентов от этой стоимости. Таблица 3-1 показывает плотность и другие физические характеристики нескольких белков крови. Более тяжелые и более плотные молекулы поселиться, или осадок, быстрее, чем более легкие или менее плотных молекул.
Таблица 3-1. Физические характеристики выбранных белков крови.
Таблица 3-1
Физические характеристики выбранных белков крови.
Центрифуга ускоряет осаждение, подвергая частиц в суспензии до центробежных сил так велика, как 600000 раз силы тяжести г. Центробежная сила пропорциональна скорости вращения ротора (измеренной в оборотах в минуту, или оборотах в минуту) и расстояния трубки от центра ротора. Современные ультрацентрифуги развивать скорость 60000 оборотов в минуту или более и генерируют силы, достаточные, чтобы осадка частиц с массами больше 10000 Дальтон (Да). Тем не менее, мелкие частицы с массами 5 Da или менее не будет оседать равномерно даже при таких высоких скоростях ротора.
Центрифугирование используется для двух основных целей: (1) в виде препаративной методике, чтобы отделить один тип материала, из других, и (2) в качестве аналитического метода для измерения физических свойств (например, молекулярная масса, плотность, форма и равновесной константы связывания) макромолекул. Константа седиментации, S, протеина равна его скорость в центробежном поле, разделенное на центробежной силы. Значение S зависит от плотности и формы белка, а также плотности и вязкости среды. Поскольку центробежная сила и плотность и вязкость среды все известно, радиус и масса молекулы могут быть рассчитаны из измерений скорости его движения в аналитической ультрацентрифуге. Постоянная оседания обычно выражается в Svedbergs (ы): 1 S = 10-13 секунд.
дифференциального центрифугирования
Наиболее распространенным первым шагом в очистки белков является разделение растворимых белков из нерастворимого клеточного материала дифференциальным центрифугированием (рис 3-40a). Центробежная сила и продолжительность центрифугирования приспособлены к тому, чтобы осадок нерастворимые вещества в таблетку. После запуска смесь клеточного гомогената выливают в пробирку и центрифугируют в центрифуге, клеточные органеллы, такие как ядер собирают в таблетку, но растворимые белки остаются в надосадочной жидкости.Фракцию супернатанта, все еще содержит большое смесь белков, которые могут быть собраны путем декантации супернатанта, а затем подвергая его дальнейших способов очистки.
Рисунок 3-40. Две общие методы центрифугирования для отделения частиц.
Рисунок 3-40
Две общие методы центрифугирования для отделения частиц. (а) дифференциального центрифугирования отделяет смесь частиц (макромолекул, клеток органа-Эллис, и клетки), которые отличаются по массе и плотности. Наиболее плотные частицы собираются в (далее ...)
Цена-Зональная Центрифугирование
На основании различий в их массе, белки могут быть отделены центрифугированием через раствор, как правило, содержащей сахарозу (инертный сахар), из увеличении плотности называемый градиент плотности. При смеси белков слой поверх градиенте сахарозы в пробирку и центрифугировали, они мигрируют вниз по трубе со скоростью, контролируемой факторов, которые влияют на константу седиментации. Белки начать с тонкой зоны в верхней части трубки и отделить в полосы или зоны (на самом деле диски), белков различных масс. Эта техника разделения плотность градиента называется скорости зонального центрифугирования (Рисунок 3-40b). Образцы центрифугировали достаточно долго, чтобы отделить молекулы, представляющие интерес. Если они центрифугировали в течение слишком короткого времени, молекулы не будет в достаточной степени отделить. Если они центрифугировали намного дольше, чем это необходимо, все молекулы в конечном итоге в осадке на дне пробирки.
Хотя скорость оседания сильно зависит от массы частицы, скорость-зональная центрифугирования редко оказывается эффективной в определении точных молекулярных масс, потому что изменения в форме также влияют скорость оседания. Точные эффекты формы трудно оценить, особенно для белков и молекул одноцепочечных нуклеиновых кислот, которые могут принимать множество сложных форм. Тем не менее, скорость-зональное центрифугирование оказалась наиболее практичный метод для разделения множества различных типов полимеров и частиц. Второй плотность градиента техника, названная равновесная плотность градиента центрифугирования, в основном используется для отдельной ДНК или органеллы (рисунок 5-24).
Перейти к:
Электрофореза Разделяет Молекулы в соответствии с их обязанности: Масса побед
Электрофорез представляет собой метод разделения, или решения, молекулы в смеси под действием приложенного электрического поля. Растворенных молекул в электрическом ходу поля, или мигрировать, со скоростью, определяемой их заряда: отношения масс. Например, если две молекулы имеют одинаковую массу и форму, один с большей суммарный заряд будет двигаться быстрее в направлении электрода. Разделение малых молекул, таких как аминокислоты и нуклеотиды, является одним из многих применений электрофореза. В этом случае небольшое падение образца наносят на полоску фильтровальной бумаги или другого пористого субстрата, который затем пропитанный раствором проводящей. Когда электрическое поле прикладывается на концах полосы, малые молекулы, растворенного в проводящем растворе движутся вдоль полосы со скоростью, соответствующей величине их заряда.
X