Нуклеиновые кислоты и матричные биосинтезы

Формат документа: docx
Размер документа: 0.13 Мб




Прямая ссылка будет доступна
примерно через: 45 сек.



  • Сообщить о нарушении / Abuse
    Все документы на сайте взяты из открытых источников, которые размещаются пользователями. Приносим свои глубочайшие извинения, если Ваш документ был опубликован без Вашего на то согласия.


НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И МАТРИЧНЫЕ БИОСИНТЕЗЫ
Первичная структура нуклеиновых кислот представляет собой линейную полимерную цепь, построенную из мономеров - нуклеотидов, которые связаны между собой 3’,5’- фосфодиэфирными связями. Полинуклеотидная цепь имеет 5’-конец и 3’-конец. На 5’-конце находится остаток фосфорной кислоты, а на 3’-конце - свободная гидроксильная группа. Нуклеотидную цепь принято записывать, начиная с 5’-конца.
В зависимости от природы моносахаридных остатков в нуклеотиде различают дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) и рибонуклеиновые кислоты (РНК). ДНК и РНК различаются также по природе входящих в их состав азотистых оснований: урацил входит только в состав РНК, тимин - только в состав ДНК.
Вторичная структура ДНК представляет собой комплекс двух полинуклеотидных цепей, закрученных вправо вокруг общей оси так, что пентозофосфатные цепи находятся снаружи, а азотистые основания направлены внутрь (двойная спираль Уотсона-Крика). Шаг спирали - 3,4 нм, на 1 виток приходится 10 пар нуклеотидов. Полинуклеотидные цепи антипараллельны, т.е. напротив 3’-конца одной цепи находится 5’-конец другой цепи. Две цепи ДНК неодинаковы по своему составу, но они комплементарны. Это выражается в том, что напротив аденина (А) в одной цепи всегда находится тимин (Т) в другой цепи, а напротив гуанина (Г) всегда находится цитозин (Ц). Комплементарное спаривание А с Т и Г с Ц осуществляется за счет водородных связей: между А и Т образуется две водородные связи, между Г и Ц - три.
Комплементарность цепи ДНК составляет химическую основу важнейшей функции ДНК - хранения и передачи генетической информации.
Типы РНК. Известны три основных вида клеточных РНК: транспортные РНК (тРНК), матричные РНК (мРНК) и рибосомные РНК (рРНК). Они различаются по месторасположению в клетке, составу и размерам, а также выполняемым функциям. РНК состоят, как правило, из одной полинуклеотидной цепи, которая в пространстве складывается таким образом, что ее отдельные участки становятся комплементарными друг другу (“слипаются”) и образуют короткие двуспиральные участки молекулы, в то время как другие участки остаются однотяжевыми.
Матричные РНК выполняют функцию матрицы белкового синтеза на рибосомах.
Рибосомные РНК выполняют роль структурных компонентов рибосом.
Транспортные РНК участвуют в транспортировке а-аминокислот из цитоплазмы к рибосомам и в переводе информации, закодированной в нуклеотидной последовательности мРНК, в последовательность аминокислот в белках.
Свойства нуклеиновых кислот
Взаимодействие цепей ДНК может быть нарушено при нагревании, приводящем к денатурации ДНК. Денатурация сопровождается увеличением поглощения при 260 нм (так называемый гиперхромный эффект). Помимо этого метода процесс денатурации можно контролировать по уменьшению вязкости раствора. При медленном остывании (отжиге) раствора ДНК, подвергнутой тепловой денатурации, две комплементарные цепи ДНК вновь соединяются с образованием исходной структуры, т.е. происходит ренатурация. На явлении денатурации и ренатурации основан метод молекулярной гибридизации - один из главных в генной инженерии.
Г ибридизация ДНК-ДНК
Если смешать растворы ДНК, выделенных из организмов разных видов, нагреть эту смесь, а затем вновь охладить, то вновь будут возникать двуспиральные структуры. При этом наряду с молекулами ДНК, идентичными исходным, могут образовываться гибридные молекулы,
РНК
урацил, цитозин, аденин,гуанин
ДНК
тимин, цитозин, аденин, гуанин
2
содержащие цепи ДНК от разных видов. Такие гибридные молекулы несовершенны: спирализованные участки в них чередуются с неспирализованными. В неспирализованных участках цепи ДНК некомплементарны друг другу. Несовершенство гибридов ДНК-ДНК выявляется с помощью электронной микроскопии.
Исследование гибридизации ДНК-ДНК позволило сделать следующие важные для биологии выводы:
ДНК всех органов и тканей одного и того же организма идентичны.
ДНК, выделенные из тканей разных особей одного биологического вида, идентичны. Небольшие различия, имеющие место, методом гибридизации не обнаруживаются.
ДНК,полученные от особей разных биологических видов, неидентичны и образуют несовершенные гибридные молекулы. Степень несовершенства гидридов ДНК-ДНК тем больше, чем отдаленнее филогенетическое сродство между видами.
Из результатов изучения ДНК методом гибридизации следует, что первичная структура ДНК характеризуется видовой специфичностью.
Гибридизация ДНК-РНК
Сходным образом происходит гибридизация ДНК-РНК. В этом случае гибридная молекула содержит одну цепь ДНК и одну - РНК.
Перенос генетической информации
Способность к переносу генетической информации, т.е. передаче наследственных свойств, является уникальным свойством живых организмов. Хранение и передача генетической информации, которую можно рассматривать как биологическую память, возложена природой на нуклеиновые кислоты.
Различают три варианта переноса генетической информации: 1) в пределах одного класса нуклеиновых кислот, т.е. от ДНК к ДНК. Он называется репликацией. 2) между разными классами нуклеиновых кислот, т.е. от ДНК к РНК. Он называется транскрипцией. В ходе транскрипции образуются все типы РНК: мРНК, тРНК и рРНК. 3) в пределах разных классов макромолекул, т.е. от мРНК к белку. Он называется трансляцией. Трансляция может происходить только в одном направлении - от мРНК к белку.
Направление переноса генетической информации от ДНК через РНК к белку называется центральным постулатом молекулярной биологии. Он был сформулирован Ф.Криком.
Все виды передачи генетической информации основаны на матричном механизме. Это означает, что для каждого из них необходима матрица, которая позволяет с большой точностью и экономичностью воспроизводить имеющуюся в клетке генетическую информацию.
Биосинтез ДНК (репликация)
Репликация - это процесс, при котором информация, закодированная в последовательности оснований молекулы родительской ДНК, передается дочерней ДНК.
В 1958 году Меселсон и Сталь в экспериментах с тяжелым азотом (N15) доказали, что репликация ДНК происходит по полуконсервативному механизму, при котором дочерние клетки первого поколения получают одну цепь ДНК от родителей, а вторая цепь является вновь синтезированной.
Для репликации ДНК необходим ряд условий:
Реакция идет только в присутствии уже готовой ДНК, выполняющей роль матрицы. Вновь синтезируемые молекулы ДНК имеют первичную структуру, идентичную первичной структуре ДНК-матрицы.
Сложный набор белков и ферментов, образующих репликативный комплекс. В него входят ДНК-топоизомеразы, которая является обратимой нуклеазой; ДНК-хеликазы, использующей энергию АТФ для расплетения двойной спирали ДНК; белков, дестабилизирующих спираль (SSB-белков); ДНК-полимераз, катализирующих образование 3’, 5'- фосфодиэфирных связей.
3
Субстратами служат дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ). В ходе ДНК-полимеразной реакции от каждого из них отщепляется пирофосфатный остаток. Таким образом, включение каждого мономера в молекулу ДНК требует расхода энергии высокоэнергетических связей.
Итак, в результате действия сложного набора белков образуется репликативная вилка. ДНК- полимераза 8 не способна инициировать синтез новых цепей ДНК. Она может лишь удлинять уже имеющуюся нуклеотидную цепь - затравку РНК (праймер). Роль завтравки выполняет РНК, синтезируемая ферментом РНК-полимеразой а. Каждый праймер состоит примерно из 10 нуклеотидов. ДНК-полимераза 5 (дельта), активируемая праймером, продолжает синтез новой цепи в направлении от 5’- к З’-концу. Поэтому на одной из ветвей репликативной вилки новая цепь наращивается непрерывно; она называется лидирующей. На другой же ветви по мере раскручивания ДНК под действием ДНК-полимеразы г (эпсилон) образуются короткие фрагменты, называемые фрагментами Оказаки. Каждый фрагмент Оказаки состоит примерно из 100 нуклеотидов. Исключение праймеров осуществляется с помощь фермента ДНК-полимеразы Р, которая постепенно отрезает от 5’-конца фрагмента по одному рибонуклеотиду и присоединяет дезоксирибонуклеотиды в количестве, равном вырезанному праймеру, заполняя образованную брешь. Затем концы этих фрагментов соединяются между собой под действием ДНК-лигазы.
Молекула ДНК человека имеет очень большие размеры. Репликация такой большой молекулы шла бы в течение примерно 800 часов. Поэтому инициация синтеза ДНК происходит в нескольких точках хромосомы, которые называются точками инициации репликации, или ориджинами репликации.
Повреждения и репарация ДНКРяд экзогенных факторов - УФ- и ионизирующее излучение, многие химические соединения - вызывают в ДНК разнообразные изменения. Например, для действия УФ- излучения характерно образование димеров тимидиловой кислоты. Ионизирующие излучения вызывают разрывы нуклеотидных цепей и разнообразные изменения азотистых оснований, что объясняет летальное действие ионизирующей радиации. Под действием разных химических соединений происходит образование ковалентных связей между цепями ДНК, дезаминирование оснований, отщепление оснований и др.
Для устранения последствий таких повреждений в клетке существуют системы репарации ДНК - ферментные механизмы, которые обнаруживают и исправляют повреждения. В общих чертах репарация происходит следующим образом. Поврежденные (например, в результате дезаминирования) азотистые основания обнаруживаются и удаляются ДНК-гликозидазами, расщепляющими связь между поврежденным основанием и дезоксирибозным остатком. В результате на молекуле ДНК образуется апуриновый или апиримидиновый участок. Специфическая ДНК-полимераза 1 узнает такие участки и гидролизует фосфодиэфирные связи и затем достраивает поврежденную нуклеотидную цепь, используя в качестве матрицы сохранившуюся цепь. И завершает репарацию ДНК-лигаза, которая ковалентно сшивает исправленную цепь.
Транскрипция ДНКТранскрипция - это процесс переноса генетической информации от ДНК к РНК. Транскрибируется только одна, так называемая “+” - цепь ДНК. При этом образуются все виды РНК (мРНК, рРНК, тРНК).
Для инициации транскрипции ДНК необходим ряд условий:
наличие ДНК в качестве матрицы. При этом в качестве матрицы служит только одна, так называемая “+”-цепь ДНК.
ДНК-зависимые РНК-полимеразы.
наличие рибонуклеозидтрифосфатов (АТФ, ГТФ, УТФ и ЦТФ) в качестве субстратов для РНК-полимеразной реакции.
4
Когда полимераза связывается с промотором, происходит локальное расплетение двойной спирали ДНК. Наращивание молекулы РНК происходит в результате перемещения полимеразы вдоль ДНК путем присоединения очередного рибонуклеотида, комплементарного тому дезоксирибонуклеотиду ДНК, который в данный момент находится в области активного центра полимеразы. Терминация (прекращение роста) цепи РНК происходит на специфических участках ДНК, называемых терминаторами. Достигнув этого участка полимераза и синтезированная РНК отщепляются от ДНК. Таким образом, получаются отдельные молекулы РНК, каждая из которых содержит информацию одного гена.
Синтез РНК происходит в направлении от 5’-конца к 3’-концу. По мере освобождения промотора к нему могут присоединяться новые молекулы полимеразы, так что ген может транскрибироваться одновременно большим количеством молекул фермента.
Созревание РНК. В результате транскрипции образуются предшественники тРНК, рРНК мРНК. Затем в ядре происходит процессинг (созревание) этих предшественников и получаются функционально активные РНК. Особенности созревания мРНК: в геноме эукариот содержатся интроны, т.е. участки ДНК, не несущие структурной информации и разбивающие ген на ряд кусков. В ходе созревания интроны удаляются, а экзоны или структурные части соединяются (сплайсинг). Кроме того, при созревании мРНК модифицируется по 5’- и З’-концам. К 5’-концу присоединяется “колпачек” или “КЭП”, а к 3’-концу - полиадениловые последовательности длиной 100-200 нуклеотидных остатков. Считается, что “КЭП” и поли-А-последовательности защищают мРНК от гидролиза РНКазами. После такой модификации мРНК переносятся из ядра в цитоплазму.
Генетический код
связывает последовательность оснований данного гена или его РНК-транскрипта с аминокйслотной последовательностью соответствующего белка.
Свойства генетического кода:
триплетность - т.е. одна аминокислота кодируется последовательностью из трех нуклеотидов, называемой кодоном.
код специфичен - т.е. каждый триплет кодирует только какую-нибудь одну аминокислоту.
код вырожден, т.е. большинство аминокислот кодируется более чем одним кодоном. Например, Phe кодируется двумя кодонами (UUU и UUC). При этом кодоны, кодирующие одну и ту же аминокислоту называются кодонами-синонимами.
код не перекрывается, т.е. в последовательности оснований ABCDEF первые три основания (ABC) кодируют аминокислоту 1, DEF - аминокислоту 2 и т.д. В коде отсутствуют запятые, т.е. нет знаков, отделяющих один кодон от другого.
кодуниверсален. У разных организмов - от вирусов и бактерий до высших животных он одинаков. Эта универсальность кода лишний раз свидетельствует о единстве происхождения всех форм жизни на Земле.
Трансляция генетического кода
Трансляция - это процесс декодирования мРНК, в результате которого информация с языка последовательности оснований мРНК переводится на язык аминокислотной последовательности белка. Направление чтения закодированной записи идет от 5’-конца мРНК к 3’-концу. Первый с 5’-конца кодон соответствует N-концевой аминокислоте пептидной цепи. Следовательно, белки синтезируются от N-конца к С-концу.
Адапторная функция тРНК
Между аминокислотами и нуклеотидами невозможны специфические, комплементарные взаимодействия. Поэтому было сделано предположение о существовании молекул-адапторов, каждая из которых может взаимодействовать с определенным кодоном - с одной стороны и с определенной аминокислотой - с другой стороны. В 1957 году такие молекулы были обнаружены - ими оказались тРНК.
5
Взаимодействие тРНК с аминокислотами с образованием аминоацил-тРНК (аа-тРНК) катализируется ферментами аминоацил-тРНК-синтетазами (АРСазами), причем для каждой аминокислоты существует, по крайней мере, один такой фермент. Источником энергии для этой реакции служит гидролиз АТФ:
аминокислота + тРНК + АТФ → аминоацил-тРНК + АМФ + ФФ
Синтез белка происходит в рибосоме. В нем участвуют множество разных ферментов и белков. Весь процесс образования пептидной цепи можно разделить на три стадии: инициация, элонгация и терминация.
Инициация. Синтез белка начинается с образования инициирующего комплекса, состоящего из большой и малой субчастиц рибосомы, мРНК и соответствующей аа-тРНК. Сначала мРНК соединяется с малой (40S) субчастицей рибосомы и инициирующей аа-тРНК, роль которой при синтезе любого белка выполняет Met-тРНК. Затем к этому комплексу присоединяется большая (60S) субчастица рибосом. Met-тРНК взаимодейсвует своим антикодоном с инициирующими кодонами AUG или GUG на мРНК, что является сигналом к началу синтеза белка. Кроме того Met-тРНК связывается с Р участком (пептидильным) на 60S- субчастице рибосом. Источником энергии для инициации синтеза белка служит реакция гидролиза ГТФ до ГДФ и Фн. На этом этапе необходимы еще несколько белков, называемых факторами инициации (IF1, IF2, IF3). После образования комплекса они вновь переходят в цитозоль.
Элонгация - это последовательное включение аминокислотных остатков в состав растущей полипептидной цепи. Каждый акт элонгации состоит из трех этапов: 1) узнавание кодона, 2) образование пептидной связи и 3) транслокация.
Узнавание кодона заключается в связывании антикодона очередной молекулы аа-тРНК со следующим (первым) кодоном мРНК, а также свободным участком А (аминоацильный участок) на бОБ-субчастице рибосомы. Связывание аа-тРНК с рибосомой сопряжено с расходованием энергии - используется одна молекула ГТФ. В этой реакции участвует внерибосомальный белок
фактор элонгации EF1.
Когда оба участка (А и Р) заняты молекулами аа-тРНК происходит образование пептидной связи. Часть 60S-субчастицы представляет собой фермент пептидилтрансферазу, катализирующий образование пептидной связи. В результате этой реакции растущая полипептидная цепь оказывается присоединенной к тРНК участка А. Таким образом, получается дипептидил-тРНК, связанный с первым кодоном и с участком А рибосомы.
Транслокация включает три акта, катализируемых еще одним фактором элонгации EF3 и энергетически сопряженных с гидролизом ГТФ. Сначала тРНК участка Р, не связанная с пептидом, покидает рибосому, затем молекула дипептидил-тРНК перемещается из участка А в участок Р и, наконец, рибосома перемещается вдоль мРНК на три нуклеотидных остатка в сторону 3’-конца. В результате этих трех актов освобождается участок А и экспонируется очередной кодон, что позволяет начаться следующему циклу элонгации.
Терминация. т.е. окончание синтеза пептидной цепи происходит по достижении терминирующих кодонов (UAA, UGA или UAG). В этом процессе участвуют специальные белки, названные факторами терминации (RF1 и RF2), которые узнают терминирующие кодоны, когда свободен участок А. В результате происходит гидролиз связи между концевым пептидом и тРНК, а освобожденная полипептидная цепь диффундирует от рибосомы. Вслед за этим происходит диссоциация комплекса мРНК - рибосома. Далее рибосома диссоциирует на 40S- и 60S- субчастицы.
Посттрансляционная достройка
После завершения синтеза полипептидных цепей они подвергаются посттрансляционной достройке, которая включает 1) ограниченный протеолиз (например, превращение проинсулина в инсулин); 2) модификацию аминокислотных остатков (например, гидроксилирование пролина и лизина -в цепях коллагена, йодирование тирозина в тиреоглобулине); 3) присоединение простетической группы с образованием сложных белков, а также объединение протомеров с образованием олигомерных белков.
6
Регуляция активности генов у прокариот
В 1961 году Жакоб и Моно для объяснения реакции бактериальных клеток на изменение окружающей их среды, высказали предположение об индукции синтеза ферментов. После введения в питательную среду лактозы в качестве субстрата они наблюдали увеличение содержания в бактериальной клетке (З-галактозидазы - фермента, катализирующего расщепление лактозы, в 100 раз. Такая активация транскрипции называется индукцией. Одновременно с лактазой индуцируется еще 2 белка: галактозидпермеаза (белок, транспортирующий лактозу через мембрану) и тиогалактозидацетилтрансфераза.
Группа близкорасположенных генов, регулируемых одним стимулом, получила название оперона. Структуру 1ас-оперона можно представить следующим образом. Три структурных гена, кодирующих вышеуказанные белки, обозначают соответственно буквами А, В, С; вместе с операторным участком (оператором, О) они образуют lac-оперон. Транскрипционную активность генов, входящих в оперон, регулирует четвертый, регуляторный ген (ген I). Этот ген кодирует регуляторное вещество, названное репрессором. В 1ас-системе репрессор представляет собой белок, который связывается с определенным участком на ДНК, называемым оператором (небольшим участком ДНК, граничащим с первым структурным геном). Когда лактозы в среде нет, белок-репрессор связывается с оператором и, поскольку участки О и Р частично перекрываются, препятствует связыванию РНК-полимеразы, блокируя тем самым инициацию транскрипции.
При поступлении в среду, лактоза, выступающая в роли индуктора, связывается с репрессором и переводит его в неактивную форму, неспособную более связываться с оператором. РНК-полимераза связывается с промотором и происходит инициация транскрипции.
Примером регуляции биосинтеза белков на уровне транскрипции у человека может служить регуляция жирорастворимыми гормонами. Стероидные гормоны и йодтиронины взаимодействуют с хроматином, стимулируя синтез определенных мРНК и соответствующих белков. Например, глюкокортикоиды вызывают индукцию синтеза ферментов глюконеогенеза в печени.
Регуляция активности генов у эукариот
В клетках млекопитающих наряду с адаптивной регуляцией, обеспечивающей приспособление организма к меняющимся условиям внутренней и внешней среды, существуют механизмы, которые обеспечивают стабильную, существующую на протяжении всей жизни клетки, репрессию одних генов и дерепрессию других. Такая регуляция определяет дифференцировку клеток и разный белковый состав органов и тканей.
Стойкая репрессия генов гетерохроматина достигается:
1 Пространственной укладкой ДНК. В ядрах дифференцированных клеток хроматин имеет такую укладку, что небольшое число генов доступно для транскрипции. Различают участки гетерохроматина, в которых ДНК упакована очень компактно и недоступна для транскрипции, и участки эухроматина, имеющие более рыхлую укладку и способные связывать РНК-полимеразу. В разных типах клеток в область эухроматина попадают разные гены, следовательно, в разных тканях транскрибируются разные участки хроматина;
метилированиемдезоксицитидина в последовательности CG под действием ДНК- метилтрансфераз. Эта модификация сильно меняет конформацию хроматина и препятствует активной транскрипции;
связываниемс гистонами и образованием нуклеосом, которые снижают транскрипционную активность ДНК.
Ингибиторы матричных биосинтезов. Их применение в медицине
Прекращение матричных биосинтезов ведет к гибели клетки. На этом основано применение антибиотиков (АБ), веществ, продуцируемых микроскопическими грибами, для лечения инфекционных болезней и злокачественных опухолей. АБ, взаимодействующие с ДНК, нарушают ее матричную функцию и подавляют репликацию или транскрипцию. Их применяют
7
для лечения опухолей. Противоопухолевые АБ не отличаются избирательностью, т.е. практически взаимодействуют с ДНК как опухолевых, так и нормальных клеток. Поэтому при лечении могут повреждаться здоровые клетки, что требует хорошо поставленного контроля при использовании противоопухолевых АБ.
АБ, взаимодействующие с белками рибосом, ингибируют трансляцию. Они применяются в основном как противобактериальные средства, отличаются достаточно высокой избирательностью и часто сравнительно мало токсичны для человека. Это объясняется различиями в строении белков рибосом и бактерий человека.
Интерфероны
группа белков, регулирующих реакцию клетки на вирусную инфекцию. Синтез интерферонов индуцируется некоторыми компонентами вирусных частиц, в частности двуспиральной РНК, имеющейся во многих вирусах. Интерферон в свою очередь индуцирует синтез фермента протеинкиназы, которая катализирует фосфорилирование фактора инициации IF2:
В результате фактор инициации утрачивает активность, и синтез белков в клетке прекращается. Кроме того, интерферон активирует латентную РНКазу (механизм активации последней связан с активацией под влиянием интерферонов 2’,5’-олиго(А)-синтазы и накоплением в клетке 2’,5’-олиго(А)), которая расщепляет матричные и рибосомные РНК. Конечно, это ведет к гибели клетки, но вместе с ней погибают и вирионы.
Ингибирование синтеза белков дифтерийным токсином
Возбудитель дифтерии, размножающийся в слизистой зева, выделяет токсин белковой природы. Этот белок, состоящий из одной полипептидной цепи с мол. массой ~ 60000, поступает в клетку, где под действием протеиназ клеток хозяина распадается на два фрагмента: А и В. Фрагмент А представляет собой фермент АДФ-рибозилтрансферазу, переносящий АДФ- рибозильный остаток с НАД+ на фактор элонгации EF2:
НАД+ + EF2 → АДФ-рибозил-ЕF2 + никотинамид
Модифицированный таким образом фактор элонгации утрачивает способность участвовать в регенерации EF1 и трансляция прекращается. Этим объясняется токсическое действие белка. Фрагмент В не обладает ферментативной активностью, не токсичен. Он необходим для проведения фрагмента А через клеточную мембрану внутрь клетки.
С действием токсина связаны все основные симптомы дифтерии. Размножающиеся бациллы выделяют токсин, вследствие чего клетки слизистой зева погибают, и развивается воспалительная реакция. Из лейкоцитов, экссудата и погибших клеток образуется пленка, которая может стать причиной асфиксии, наиболее опасного осложнения дифтерии. Кроме того, дифтерийный токсин вызывает поражение сердца, что является частым осложнением заболевания.
Молекулярные механизмы генетической изменчивости
Естественный отбор и биологическая эволюция невозможны без генетической изменчивости, которая возникает за счет мутаций и рекомбинаций в процессе мейоза. В последнем случае происходит обмен участками ДНК между гомологичными хромосомами родителей. С изменчивостью связаны такие явления как гетерогенность популяций человека и существование наследственных болезней.
Генные мутации
Мутации — это нерепарированные изменения первичной структуры ДНК, появляющиеся в молекуле в ответ на дефекты в работе ДНК-полимераз или ДНК-репарирующих систем, воздействия внешней и внутренней среды.
Точечные мутации (затрагивающие один нуклеотид ДНК) в основном бывают трех видов: замены (это наиболее распространенный тип повреждений молекулы ДНК), вставки и делении (или выпадения) нуклеотидов.

Каждый тип мутации вызывает разные последствия: так, замена нуклеотида а) может быть “молчащей” и не проявиться в белке, если кодирующий триплет, в котором находится мутантный нуклеотид, из-за вырожденности кода обеспечивает включение в белок той же аминокислоты, что исходный кодон; б) может сопровождаться включением в белок одной измененной аминокислоты (миссенс-мутация). Так возникла, например, мутация, проявляющаяся как серповидно-клеточная анемия: кодон, ответственный за включение Glu в положение 6 (3-цепи гемоглобина, превратился в кодон Val; в) если в результате замены образуется один из терминирующих кодонов - UAA, UAG или UGA (нонсенс-мутация), то синтез пептидной цепи обрывается и получается укороченный вариант белка.
Делеции и вставки также приводят к неоднозначным результатам: а) если включается или выпадает один нуклеотид или участок ДНК, в котором число нуклеотидов не кратно трем, то происходит сдвиг рамки считывания информации и при трансляции вся информация, расположенная за местом мутации, считывается неверно. В результате такой мутации синтезируется белок с бессмысленной последовательностью аминокислот. Такого типа мутации вызывают вещества, интеркалирующие (встраивающиеся) между азотистыми основаниями молекулами ДНК; б) если выпадает или включается в ДНК участок с длиной цепи, кратной 3, то сдвига рамки не происходит (делеция или вставка без сдвига рамки считывания информации). Белок, который зашифрован такой мутацией, будет либо укорочен (при делеции), либо удлинен (при вставке) на одну или несколько аминокислот.
В большинстве случаев мутации влияют на экспрессию или структуру генов, что проявляется в снижении количества или изменении структуры белкового продукта, а, следовательно, и его функциональной активности. Иногда снижение ил полное отсутствие белка является результатом мутаций в регуляторных участках генов.
Мутации в половых клетках передаются по наследству и могут проявляться в фенотипе потомства как наследственная болезнь, связанная со структурным или функциональным изменением белка. В соматических клетках мутации могут вызвать различные функциональные нарушения, такие как непереносимость некоторых пищевых и лекарственных веществ, предрасположенность к определенным заболеваниям, а иногда трансформацию клеток и развитие опухолей.
Полиморфизм белковУ разных особей возникают варианты (мутации) разных генов или варианты одного и того же гена. Варианты генов, образующиеся у отдельных особей, могут постепенно распространяться в популяции в результате наследования, если они не детальны. Так формируется генотипическая неоднородность популяции, которая ведет и к фенотипической неоднородности. На молекулярном уровне наиболее изучен (как следствие генотипической гетерогенности) полиморфизм белков - существование разных форм белка, выполняющего одинаковые или очень сходные функции (изобелки).
Причинами, приводящими к образованию изобелков, являются: 1) мутации; 2) рекомбинации. Гомологичные хромосомы половых клеток в процессе мейоза могут обмениваться аллелями или их частями. Если при рекомбинации аллельные гены обмениваются не целиком, а участками меньшей длины, то такой обмен будет приводить к появлению новых, прежде не существовавших в популяции аллелей (а не просто новых сочетаний прежних аллелей). Рекомбинации - гораздо более частые события, чем мутации, поэтому разнообразие форм внутри вида обусловлено главным образом именно рекомбинациями; 3) амплификация генов. При дихотомической эволюции происходит удвоение генов, т.е. образуются новые генные локусы: сначала это копии исходного гена, но последующие мутации копий приводят к появлению в организме изобелков. В этом случае варианты белка являются продуктами разных генных локусов, а не аллельных генов.
Т.о., изобелки - это множественные молекулярные формы белка, обнаруживаемые в пределах организмов одного биологического вида, как результат наличия в генотипе вида множественных аллелей или множественных генных локусов.
9
Примеры полиморфизма белков. Гемоглобин
Гемоглобины А (α2β2), А2 (α2δ2), F (α2γ2) содержатся в эритроцитах всех людей. Гены этих белков не аллельны - они занимают разные локусы. Эти гены возникли в результате дупликации гена-предшественника и последующих независимых мутаций. Но в крови некоторых людей обнаруживаются гемоглобины, являющиеся продуктами аллельных генов. Один из вариантов — это HbS. По аллелям НЬА и HbS все люди делятся на три группы с генотипами АА, AS и SS. У людей первой группы эритроциты содержат НЬА, у второй - НЬА и HbS, у третьей - HbS. Распространенность аллеля S - людей с генотипами AS и SS - географически неравномерна: у некоторых народностей Азии и Африки - до 35%, тогда как у европейцев встречается редко.
Существует еще один вариант гемоглобина: НЬ С (β6Glu→Lys). По этой паре аллелей существуют генотипы АА, АС и СС. Теперь всех людей можно разделить на пять генотипически и фенотипически разных групп: АА, AS, SS, АС, СС. Известно около 300 аллельных вариантов гемоглобина А. Следовательно, по всем аллелям НЬА люди образуют около 600 генотипически различающихся групп.
Группы крови
Групповая принадлежность крови определяется системой АВО, имеющей важное значение для практики переливания крови.
Интегральный гликопротеин глифорин присутствует только в плазматической мембране эритроцитов. К N-концевой части белка, расположенной на наружной поверхности мембраны, прикреплено около 20 олигосахаридных цепей. Олигосахариды гликофорина - антигенные детерминанты системы групп крови АВО.
У .созревающих эритроцитов этот олигосахарид имеет последовательность: фукоза - галактоза - N-ацетилглюкозамин - R. Олигосахарид ковалентно связан с липидами мембраны. При созревании эритроцита олигосахарид удлиняется на один моносахаридный остаток. Присоединение моносахарида к галактозе катализирует фермент гликозилтрансфераза. В популяции человека встречаются три аллельных гена этого фермента (А, В и О) и соответственно три аллельных варианта фермента, которые обозначаются теми же буквами. Варианты фермента А и В различаются по субстратной специфичности: вариант А присоединяет к олигосахариду N- ацетилгалактозу, а вариант В - галактозу. Аллельный ген О кодирует синтез белка, не имеющего ферментативной активности. Т.о. разные аллели обусловливают образование гликозилтрансфераз, катализирующие процессы:
аллель А → фермент А → олигосахарид А
аллель В → фермент В → олигосахарид В
аллель О → неактивный белок → олигосахарид не достроен.
Разветвленные олигосахариды А и В являются антигенами. К каждому из них могут вырабатываться антитела. При смешивании раствора анти-А с кровью, эритроциты которой содержат антиген А, происходит агглютинация эритроцитов. То же происходит при встрече анти- В с эритроцитами, содержащими антиген В. Поэтому при переливании крови руководствуются правилом: кровь донора и реципиента не должна содержать антиген и антитело, реагирующие между собой, иначе произойдет агглютинация эритроцитов и гемолиз.
Биохимическая индивидуальность
В настоящее время известны десятки белков, для которых найдены множественные формы. Есть основания считать, что у значительной части из десятков тысяч структурных локусов генома человека имеются аллели. А это значит, что число разных генотипов может быть практически неисчерпаемым.
10
Полиморфизм белков и других биохимических структур настолько велик, что можно говорить о биохимической индивидуальности. С биохимической индивидуальностью связаны и индивидуальные особенности развития и здоровья.
Использование ДНК-технологий в медицине
Получение рекомбинантных ДНК.
Получение гена или его фрагмента осуществляется, как правило, с использованием рестриктаз - ферментов из группы эндонуклеаз, “узнающих” определенную последовательность нуклеотидов ДНК и расщепляющих обе нити. Расщепление обеих нитей ДНК может происходить двояким путем с образованием двухцепочечных (“слепых”) или одноцепочечных (“липких”) концов.
Ген или его фрагмент, имеющий “липкий” конец, может по принципу комплементарности взаимодействовать с “липким” концом другого, не родственного ему фрагмента ДНК, полученного при действии на ДНК одной и той же рестриктазы. Фрагменты ковалентно соединяют друг с другом с помощью ДНК-лигазы и получают рекомбинантные (гибридные) ДНК. Далее, с помощью вектора, обычно ретровируса, чужеродный ген вводится в бактерию, и здесь обеспечивается репликация, транскрипция и трансляция с образованием нужного продукта.
С помощью техники рекомбинантных ДНК оказалось возможным: а) использовать микроорганизмы в качестве продуцентов веществ, необходимых для человека (инсулин, гормон роста, VIII фактор свертывания крови для лечения гемофилии); б) лечить наследственные и ненаследственные (инфекционные) заболевания путем введения генов в клетки пациентов для устранения дефектов генов или придания им новых функций. Впервые эта задача была успешно решена в 1990 году, когда 4-летней девочке, страдающей наследственным иммунодефицитом, вызванным мутацией в гене аденозиндезаминазы, были пересажены ее собственные лимфоциты, предварительно трансформированные вне организма рекомбинантной ДНК, содержащей ген аденозиндезаминазы и ретровирусный вектор. В настоящее время предпринимаются попытки лечения подобным способом некоторых наследственных заболеваний, а также ВИЧ-инфекции.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
метод получения большого числа копий (несколько миллионов) гена или его фрагмента за короткий период времени в условиях репликации in vitro, требующий очень малых количеств исходной ДНК в образце. Объектами для выделения ДНК могут быть кровь, раневое отделяемое и т.д. Метод широко используется, в частности, в микробиологии для тестирования инфекционных возбудителей.
Катаболизм пуриновых нуклеотидов включает реакции гидролитического отщепления фосфатного остатка, фосфоролитического отщепления рибозного остатка и аминогруппы. Конечным продуктом расщепления пуринов в организме человека является мочевая кислота. Последняя выделяется с мочой.
Обмен нуклеотидовРаспад пуриновых нуклеотидов
Распад АМФВ результате вышеперечисленных реакций из АМФ образуется гипоксантин:
Гипоксантин далее превращается в ксантин, а ксантин в мочевую кислоту. Эти реакции катализирует ксантиноксидаза.
Распад ГМФГуанозинмонофосфат превращается в ксантин и далее в мочевую кислоту.
Биосинтез пуриновых нуклеотидовВ экспериментах с мечеными веществами еще в 50-ых годах XX века было выяснено происхождение атомов в пуриновом кольце пуриновых нуклеотидов. Оказалось, что пуриновая структура образуется из мелких фрагментов, поставляемых разными соединениями.



12
Позднее была изучена вся последовательность реакций, ведущих к образованию пуриновых нуклеотидов. Синтез начинается с образования 5-фосфорибозил-1 -амина. Затем к аминогруппе присоединяется остаток глицина и далее последовательно протекают реакции образования пуринового ядра с использованием метенильной группы метенил- Н4-фолата, амидной группы глутамина, углекислого газа, аминогруппы аспарагиновой кислоты, формильного остатка формил-Н4-фолата. Результатом является образование инозиновой кислоты.

Инозиновая кислота - это нуклеотид, пуриновая часть которого представлена гипоксантином. Инозиновая кислота служит предшественником основных пуриновых нуклеотидов - АМФ и ГМФ.
Под действием специфических киназ нуклеозидмонофосфаты (АМФ и ГМФ) превращаются в нуклеозиддифосфаты и нуклеозидтрифосфаты.

Регуляция биосинтеза пуриновых нуклеотидовЛимитирующей стадией биосинтеза пуриновых нуклеотидов является реакция образования 5’-фосфорибозил-1-амина. Фермент, катализирующий эту реакцию, ингибируется АМФ и ГМФ. Кроме того, эта метаболическая цепь регулируется в месте ее разветвления: АМФ ингибирует реакцию образования аденилосукцината, а ГМФ - реакцию образования ксантиловой кислоты (ксантозинмонофосфата).
Биосинтез пуриновых нуклеотидов из аденина и гуанинаВ результате превращений нуклеотидов в тканях постоянно образуются свободные пуриновые основания - аденин и гуанин. Они могут повторно использоваться для синтеза

13
14
нуклеотидов при участии ферментов аденинфосфорибозилтрансферазы и гипоксантин- гуанин-фосфорибозилтрансферазы:
аденин + фосфорибозилдифосфат → АМФ + Н4Р2О7
гуанин + фосфорибозилдифосфат → ГМФ + Н4Р2О7
Этот механизм повторного включения азотистых оснований в метаболизм называют “путем спасения”. Он имеет вспомогательное значение, давая от 10 до 20% общего количества нуклеотидов.
В результате совместного действия этих ферментов снижается выход конечного продукта обмена пуринов - мочевой кислоты.
Другой “запасной путь” включает фосфорилирование пуриновых нуклеотидов при участии АТФ. Так, аденозинкиназа катализирует фосфорилирование аденозина до АМФ или дезоксиаденозина до дАМФ:
Аденозин + АТФ → АМФ + АДФ
Гиперурикемия. ПодаграВ крови здоровых мужчин содержится 0,18-0,53 ммоль/л и здоровых женщин - 0,15-0,45 ммоль/л мочевой кислоты. Хроническое повышение концентрации мочевой кислоты в крови (гиперурикемия) часто приводит к развитию подагры. Клиническая картина подагры характеризуется: 1) повторяющимися приступами острого воспаления суставов, чаще всего мелких, вследствие отложения кристаллов урата натрия в суставе 2) образованием подагрических узлов (тофусов), возникающих в результате местного отложения и накопления уратов. Образование узлов в суставах деформирует их и нарушает функцию. Отложение уратов в ткани почек приводит к почечной недостаточности - частому осложнению подагры.
Подагра - распространенное заболевание: в разных странах им страдает от 0,3 до 1,7% взрослого населения, причем мужчины болеют в 20 раз чаще, чем женщины. Гиперурикемия чаще всего имеет наследственный характер.
Известна тяжелая форма гиперурикемии - синдром Леша-Нихана, который наследуется как рецессивный признак, сцепленный с Х-хромосомой. У больных мальчиков кроме симптомов, характерных для подагры, наблюдаются церебральные параличи, нарушения интеллекта, попытки наносить себе раны (укусы пальцев, губ). Эта болезнь связана с дефектом фермента - гипоксантин - гуанин-фосфорибозилтрансферазы, вследствие чего гипоксантин и гуанин не могут использоваться повторно для синтеза нуклеотидов, а целиком превращаются в мочевую кислоту, что и ведет к гиперурикемии.
Основным препаратом, который используется для лечения гиперурикемии, является аллопуринол - структурный аналог гипоксантина. Аллопуринол является конкурентным ингибитором ксантиноксидазы и его прием снижает содержание мочевой кислоты до нормальных величин. Содержание гипоксантина при этом возрастает. Однако гипоксантин примерно в 10 раз лучше, чем мочевая кислота, растворяется в крови и моче, и поэтому легче выводится из организма.
Распад пиримидиновых нуклеотидовПод действием нуклеотидаз и нуклеозидфосфорилаз уридиловая кислота (УМФ) распадается до урацила, цитидиловая кислота (ЦМФ) - до цитозина, тимидиловая кислота (ТМФ) - до тимина.
15
Биосинтез пиримидиновых нуклеотидовПредшественником цитидиловых и тимидиловых нуклеотидов служит уридиловая кислота (УМФ), которая образуется из углекислого газа, амидной группы глутамина и аспарагиновой кислоты.
Синтез УМФ de novo, включающий 6 последовательных стадий, протекает главным образом в цитозоле клеток при участии 3 ферментов, 2 из которых являются полифункциональными.
Первый полифункциональный фермент содержит домены, имеющие активность карбамоилфосфатсинтетазы II, аспартаткарбамоилтрансферазы и дигидрооротазы, и катализирует первые 3 реакции этого метаболического пути.
Митохондриальная НАД-зависимая дигидрооротатдегидрогеназа окисляет дигидрооротат в оротат.
Второй полифункциональный фермент катализирует превращение оротата в нуклеотид и его последующее декарбоксилирование до УМФ, т.е. проявляет оротатфосфорибозилтрансферазную и оротидилатдекарбоксилазную активности.
Первая реакция синтеза УМФ - это образование карбамоилфосфата:
СО2 + глутамин + 2 АТФ + Н2О → карбамоилфосфат + глутамат + 2 АДФ + Фн
Реакция катализируется карбамоилфосфатсинтетазой II, локализованной в цитозоле всех клеток организма (в противоположность карбамоилфосфатсинтетазе I, локализованной в митохондриях печени).
Далее карбамоилфосфат в реакции с аспарагиновой кислотой образует карбамоиласпарагиновую кислоту, которая превращается в дигидрооротовую кислоту.

16
Из УМФ при действии специфических киназ образуются УДФ и УТФ:
УМФ + АТФ → УДФ + АДФ
УДФ + АТФ → УТФ + АДФ
Путем аминирования УТФ образуется ЦТФ:
Регуляция биосинтеза пиримидиновых нуклеотидовОсуществляется на уровне первого полифункционального фермента. УТФ является аллостерическим ингибитором карбамоилфосфатсинтетазы II, а ФРПФ - аллостерическим активатором. Этот механизм предотвращает избыточный синтез не только УМФ, но и других пиримидиновых нуклеотидов, поскольку они образуются из УМФ.


17
Биосинтез дезоксирибонуклеотидовДезоксирибонуклеотиды образуются из рибонуклеотидов при участии рибонуклеотидредуктазного комплекса, который катализирует восстановление гидроксильной группы во 2’ положении рибозного остатка. Субстратами являются дифосфаты нуклеотидов.
Рибонуклеотидредуктазный комплекс состоит из рибонуклеотидредуктазы (РНР), белкового кофактора тиоредоксина и системы его регенерации: фермента тиоредоксинредуктазы и НАДФН·Н+.
Другой тип рибонуклеотидредуктазного комплекса состоит из рибонуклеотидредуктазы (РНР), белкового кофактора глутаредоксина и системы его регенерации: глутаредоксинредуктазы и глутатиона (G-SH).
РНР — аллостерический фермент. Его активность зависит от концентрационных соотношений дезоксирибонуклеотидов. дАТФ является ингибитором восстановления всех рибонуклеотидов.
Биосинтез тимидиловых нуклеотидовТимидиловая кислота (дТМФ) образуется из дезоксиуридиловой кислоты (дУМФ) в реакции, катализируемой тимидилатсинтазой:


18
Скорость синтеза дТМФ зависит от скорости восстановления продукта реакции Н2- фолата в Н4-фолат под действием фолатредуктазы. Эта реакция ингибируется метотрексатом, который используется в комплексной терапии лейкозов.
Образование дУМФ осуществляется двумя путями: 1) дефосфорилированием дУДФ или дефосфорилированием дЦДФ и последующим гидролитическим дезаминированием дЦМФ с помощью дЦМФ-дезаминазы. В организме человека преобладает второй путь.
Синтез дезоксирибонуклеотидов в покоящихся клетках практически не происходит и активируется на стадиях клеточного цикла, предшествующих делению. Ингибиторы синтеза дезоксирибонуклеотидов делают невозможной репликацию ДНК и деление клетки. На этом основано применение ингибиторов тимидилатсинтазы (например, 5-фтордезоксиуридина) для лечения злокачественных опухолей.
ОротацидурияОротацидурией называют выделение с мочой больших количеств оротовой кислоты. Наследственная оротацидурия связана с недостаточностью ферментов, катализирующих реакции образования и декарбоксилирования оротидиловой кислоты. В результате возникает недостаточность пиримидиновых нуклеотидов, необходимых для синтеза нуклеиновых кислот, оротовая кислота при этом, наоборот, накапливается. При отсутствии лечения наследственная оротацидурия приводит к резкому отставанию в умственном и физическом развитии, что является следствием “пиримидинового голода”. Поэтому для лечения этой болезни применяют уридин или цитидин. Они обеспечивает образование УМФ:
уридин + АТФ → УМФ + АДФ
а, следовательно, и других пиримидиновых нуклеотидов. Такое лечение устраняет “пиримидиновый голод”, но должно продолжаться без перерывов на протяжении всей жизни.
X