Габа 2

Формат документа: docx
Размер документа: 1.74 Мб




Прямая ссылка будет доступна
примерно через: 45 сек.



  • Сообщить о нарушении / Abuse
    Все документы на сайте взяты из открытых источников, которые размещаются пользователями. Приносим свои глубочайшие извинения, если Ваш документ был опубликован без Вашего на то согласия.


СОДЕРЖАНИЕ
Введение 2
Глава 1. Литературный обзор 4
1.1 Систематическое положение и распространение штамма Ochrobactrum 4
1.2 Морфофизиологические особенности рода Ochrobactrum 7
Глава 2. Объекты и методы исследований 9
2.1 Объект исследования 9
2.2 Методы исследования 9
2.2.1 Изучение культуральных и морфологических признаков штамма Ochrobactrum 9
2.2.2 Цитологические особенности штамма Ochrobactrum 11
Глава 3. Результаты исследований 16
3.1 Культуральные и морфологические признаки штамма Ochrobactrum 16
3.2 Цитологические признаки штамма Ochrobactrum 17
Выводы 22
Список литературы 23
ВВЕДЕНИЕ
Род Ochrobactrum относится к семейству Brucellaceae в Rizobiales. Род был описан Б. Холмсом в 1988 году, а род в качестве типового вида был выбран Ochbactrum anthropi. Дальнейшая работа привела к признанию 16 других разновидностей, в общей сложности 18. Каждый вид характеризуется общими свойствами, характерными для рода Ochrobactrum. (Romano, 2009)
Первоначально, род имел название Achromobacter species, и являлся представителем вида бактерий, обитающих в почве, однако с открытием организма, стало известно о их локализации так же в организме человека.
Данные образцы были локальны в крови, отделяемого цервикального канала, из зева, отделяемого уха, в прямой кишке, моче, бронхиальной кисте, мочевого пузыря, содержимого раны. Обширное распространение Ochrobactrum имеет в природе, они способны колонизировать, исключительно, широкое разнообразие сред обитания, начиная от агрессивных сред, таких как загрязненные почвы, воды и растения, заканчивая внутреннюю среду человека. Их можно в желудочно кишечном тракте человека и животных.
Известно его влияние на организм человека, а именно вызывание гнойно-воспалительных процессов в организме человека. (Kettaneh, 2003)
Впервые род был выделен из проб почвы сельскохозяйственной местности (а именно, из сыпучего грунта) и в дальнейшем описан английским микробиологом, Б. Холмсом. Первоначально, до открытия организма, как рода, данный организм представляли как представителем рода Rhizoplane, имеющим схожие свойства. Бактерии рода Rhizoplane обитают в корневищах сельскохозяйственных растений, таких как пшеница. Однако, исследования на генетическом уровне показали, что выделенный организм и Rhizoplane имеют относительно разный набор ДНК. В результате, в 1988 году был открыт новый организм под названием Ochrobactrum. (Kettaneh, 2003)
Целью курсовой работы является изучение цитологических особенностей штамма Ochrobactrum, выделенного из накопительной культуры с полимерсодерщащими материалами.
- рассмотреть систематическое положение штамма Ochrobactrum sp.;
- изучить культуральные, морфологические и тинкториальные признаки штамма Ochrobactrum sp.;
- изучить цитологические особенности штамма Ochrobactrum sp.
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1 Систематическое положение и распространение штамма Ochrobactrum sp.
Род Ochrobactrum на 2016 год имеет около 16 известных штаммов. В качестве типового организма именуют Ochrobactrum anthropi, который является первым представителем своего рода. На данный момент известны следующие штаммы рода Ochrobactrum:
Ochrobactrum anthropiOchrobactrum ciceriOchrobactrum cytisiOchrobactrum daejeonenseOchrobactrum gallinifaecisOchrobactrum grignonenseOchrobactrum guangzhoueneOchrobactrum haematophilumOchrobactrum intermediumOchrobactrum lupiniOchrobactrum oryzaeOchrobactrum pecorisOchrobactrum pituitosumOchrobactrum pseudintermediumOchrobactrum pseudogrignonenseOchrobactrum rhizosphaeraeOchrobactrum thiophenivoransOchrobactrum triticiНа основании филогенетических особенностей данного организма, было собранно полное генетическое «древо» бактерии рода Ochrobactrum. (Рис. 1.)

Рисунок 1. Генетическое древо рода Ochrobactrum
(www.aem.asm.org)
Бактерии данного рода активно применяются в Биотехнологии, к примеру – биосорбция металлов. Благодаря участию этих бактерий, происходит удаление токсичных металлов (хрома, кадмия, меди) из загрязненных сточных вод или грунта.
Бактерия Ochrobactrum anthropi, выделенная из ила, продемонстрировала активное поглощение металла. Учеными был сделан опыт: в пробу воды были добавлены примеси трёх видов металлов – Хрома (VI), Кадмия (II) и Меди (II), далее в эту среду был добавлена тонкозернистая, мягкая порода с содержанием изучаемого штамма бактерий. Спустя два дня концентрация металлов в толще воды существенно снизилась, что доказало сорбционные особенности бактерий (www.sciencedirect.com).
Систематическое положение штамма Ochobactrum sp.:
Царство – Bacteria
Тип — ProteobacteriaКласс — α-proteobacteriaПорядок — RhizobialesСемейство — BrucellaceaeРод — Ochrobactrum
Вид — Ochrobactrum sp.
Бактерии рода Ochrobactrum в аэробных условиях на среде с солью аммония образуют кислоту из глюкозы, арабинозы, этанола, фруктозы, рамнозы и ксилозы. Растут за счет использования β-гидроксибутирата. (http://www.labome.org).
Штамм Ochrobactrum sp. является патогенным микроорганизмом, поэтому встретить его можно в кишечнике человека и животных. Непосредственно в организм, бактерии попадают из почвы в результате использования их местообитания в качестве пахотных условий и дальнейшего попадания в организм через выросшие сельскохозяйственные плоды.  
1.2 Морфофизиологические особенности рода Ochrobactrum
Организм является облигатно аэробным, обладающим респираторным типом обмена веществ с О2 в качестве терминального акцептора электронов. А так же различные аминокислоты и углеводы в качестве источников энергии. (https://www.researchgate.net)
Род Ochrobactrum представляет собой палочки с параллельными сторонами и закругленными концами, как правило, одиночные. Клетки примерно 0,6-1,2 до 2 мкм в длину.
Все представители рода являются грамотрицательными бактериями, неспорообразующими (рис.2).

Рисунок 2. Г- неспорообразующие палочки Ochrobactrum
(http://www.microbewiki.kenyon.edu)
На плотных средах Ochrobactrum характеризуются сплошным ростом. Колония матового цвета, складчатой формы, по краям менее плотная, чем в центре. По типу питания является сапрофитом, что продемонстрировал, используя, цитраты в качестве источника углерода.
Так же род Ochrobactrum отлично усваивает аспарагин, аргинин, аланин; слабо усваивает валин, лизин. Способен окислять углеводороды нефти. (http://www.thewatchers.us)
Данная бактерия считалась возбудителем сепсиса, а так же инфекционного эндокардита и остеомиелита. Способность к возбудителю болезни послужили особенности строения бактерии: а именно за счет способности прилипать к синтетическим материалам и способности к передвижению за счет перетрихиальных жгутиков.
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1 Объект исследования

Объектом исследования являлся бактериальный штамм Ochrobactrum, выделенный из накопительной культуры с полимерсодержащими материалами.
2.2 Методы исследования
2.2.1 Изучение культуральных и морфологических признаков
штамма Ochrobactrum
Культуральные признаки колоний и характер роста по штриху отмечаем визуально. При этом обращаем внимание на профиль, край, поверхность, структуру, консистенцию и цвет колонии.
Культуральные признаки микроорганизмов на твердой среде изучали по следующим показателям:
- рост по штриху – сплошной с ровным краем, сплошной с волнистым краем, четковидный, диффузный, перистый, ризоидный;
- профиль колонии – плоская, выпуклая, кратерообразная;
- край колонии – гладкий, волнистый, зубчатый, лопастной, реснитчатый;- поверхность колонии – гладкая, морщинистая, складчатая;
- оптические свойства колонии – прозрачная, просвечивающая, непрозрачная, блестящая, матовая;
- структура колоний – однородная, мелко- или крупнозернистая, радиально или концентрически исчерченная, врастающая в агар, легко снимающаяся иглой с агара;
- консистенция – маслянистая, тестообразная, сметанообразная, слизистая, сухая, плотная (Нетрусов, 2005).
Техника приготовления фиксированного препарата
Фиксация – такая обработка живого объекта, которая дает возможность быстро прервать течение жизненных процессов в объекте, сохранив его тонкую структуру. В результате фиксации клетки прочно прикрепляются к стеклу и лучше прокрашиваются (Егоров, 1995).
Приготовление мазка
На чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю дистиллированной воды. Для обезжиривания стекол используют 96 %-й этиловый спирт. Прокаленной бактериологической петлей из пробирки с культурой берут небольшое количество микробной массы и вносят в каплю воды. Каплю тщательно распределяют по центру предметного стекла. Остатки культуры на мазке сжигают в пламени горелки. Мазок должен быть тонким, равномерно растертым и небольшим. Мазок фиксируют в пламени горелки, пронося над ее самой горячей частью 3 раза и оставляют высушивать на воздухе при комнатной температуре (Теппер, 2004).
Определение размера клеток
Измерения производили, пользуясь окулярным микрометром, значение которого было определено. Для этого сопоставили шкалу окулярного микрометра со шкалой объектного микрометра, линеечка которого равна 1 мм и разделена на 100 частей. Следовательно, одно деление объектного микрометра равно 0,01 мм, или 10 мкм. Объектный микрометр поместили на столик микроскопа и при тех же увеличениях, при которых производили измерения микробов, определили, сколько делений окулярного микрометра придется на одно деление объектного микрометра. По установлении значения деления в дальнейшем пользовались уже только окулярным микрометром, но всегда при одном и том же увеличении микроскопа (Нетрусов, 2005).
2.2.2 Цитологические особенности штамма Ochrobactrum
Цитологические признаки изучались с помощью приготовления фиксированных препаратов и различных типов окрашивания, в зависимости от того, какой компонент микробной клетки мы изучали.
Тинкториальные признаки бактерий характеризуют их способность вступать в реакцию с красителями и окрашиваться определенным образом.
Окраска клеточной стенки по Граму1. На обезжиренном стекле сделать мазок микроорганизмов.
2. Препарат высушить на воздухе, зафиксировать над пламенем горелки.
3. Препарат окрашивать 30 сек раствором кристаллического фиолетового.
4. Краситель слить и не промывая мазок водой обработать его 30 сек раствором люголя.
5. Раствор люголя слить с поверхности мазка.
6. Препарат обесцветить в течение 15 сек 96 %-м этиловым спиртом, быстро промыть водой.
7. Дополнительно окрасить мазок водным фуксином в течение 1 мин.
8. Краситель слить, препарат промыть водой, высушить.
9. Препарат микроскопировать в иммерсионной системе (Сопрунова, 2006).
Экспресс-метод определения грам-типа микроорганизма
Метод основан на разрушении грамотрицательных бактерий в щелочной среде
1. На обезжиренное предметное стекло наносим каплю 3 % раствора КОН.
2. Вносим в ту каплю петлю с исследуемой культурой и тщательно перемешиваем.
3. При тестировании грамотрицательных культур через 5-7 сек при движении петли вверх образуется слизистый след длиной 1-2 см; если след не образуется, то тестируемая культура грамположительная (Шадрина, 2007).
Определение кислотоустойчивости микроорганизмов –
окраска по Циль-Нильсену1. Фиксированный на пламени горелки мазок накрыть фильтровальной бумагой.
2. Налить на нее карболовый раствор фуксина и подогреть; при появлении паров прекратить нагревание и оставить краску на препарате еще на несколько минут (2-3 мин).
3. Дав препарату остыть, удалить пинцетом бумажку и обмыть мазок водой.
4. Обесцветить препарат 5-10 %-м водным раствором H2SO4 в течение 3-5 мин (до желтоватого оттенка мазка).
5. Мазок тщательно промыть водой.
6. Сполоснуть мазок 96 %-м спиртом.
7. Снова промыть водой.
8. Докрасить мазок в течение 3-5 мин леффлеровской метиленовой синькой.
9. Краску смыть водой и препарат высушить.
10. Микроскопировать в иммерсионной системе (Нетрусов, 2005).
Окраска жгутиков по методу Леффлера в модификации Пешкова
1. Клетки осторожно взять петлей и перенести в пробирку с теплой стерильной водой.
2. Каплю суспензии просмотреть под микроскопом и убедиться в том, что клетки хорошо подвижны и плотность суспензии составляет 5-10 клеток в поле зрения.
3. Стекло 3-4 раза пронести через наиболее горячую часть пламени горелки.
4. Дать стеклу остыть.
5. Петлей нанести 3-4 капли суспензии на обожженную поверхность стекла.
6. Высушенный мазок залить на 15 мин протравой.
7. Протраву смыть дистиллированной водой.
8. Далее препарат окрашивать в течение 5 мин разбавленным фуксином Циля, погружая его мазком вниз в раствор красителя.
9. Препарат промыть водой, высушить на воздухе.
10. Микроскопировать в иммерсионной системе (Дикий, 2002).
Окраска жгутиков по методу Уварова
1. Для приготовления эмульсии в физиологический раствор, налитый в чистую пробирку в количестве 5 мл, осторожно погрузить петлю со свежей культурой для получения слабой эмульсии. Легкими круговыми движениями пробирки между ладонями эмульсию равномерно смешать, затем добавить в нее одну каплю формалина.
2. Нанести на чистое предметное стекло каплю эмульсии и подсушить препарат.
3. На высохший нефиксированный препарат налить раствор А, подогреть над пламенем, при слабом отхождении паров 1-2 мин.
4. Смыть препарат водой и слегка подсушить.
5. Затем на препарат налить раствор В, нагреть препарат 1-2 мин до слабых паров, обильно промыть и высушить.
Раствор А: смесь растворов «а» и «б» в пропорции 1:2.
Раствор «а» – насыщенный водный раствор калийных квасцов; раствор «б» – раствор сульфаниловой кислоты о,5 г + HCl 1,5 мл.
Раствор В: смесь растворов «в» и «г» в пропорции 3:1.
Раствор «в» – раствор Мюра: насыщенный водный раствор калийных квасцов KAl(SO4)2×12H2O 25 мл + насыщенный спиртовой раствор генцианвиолета 5 мл; раствор «г» – насыщенный спиртовой раствор основного фуксина (Шадрина, 2007).
Окраска нуклеоида бактерий
1. Из суточной культуры бактерий приготовить суспензию и нанести мазок на предметное стекло.
2. Мазок высушить на воздухе и зафиксировать смесью Никифорова в течение 2-3 мин.
3. Для фиксации мазка на дно чашки Петри нанести 2-3 капли фиксатора, а предметное стекло поместить на обрезки стекла мазком вниз.
4. Далее мазок подвергнуть гидролизу в 1 н. растворе HCl при t=60 ˚С 2-3 мин и немедленно тщательно промыть препарат водой.
5. Затем мазок залить 1 %-м раствором формалина на 1,5 мин и вновь промыть водой.
6. Мазок окрасить 1 %-м водным раствором основного фуксина 1-2 мин, промыть водой, высушить на воздухе и микроскопировать в иммерсионной системе (Шадрина, 2007).
Выявление гликогена и гранулезы в клетках бактерий
1. На обезжиренное предметное стекло нанести каплю микробной взвеси и добавить каплю раствора люголя.
2. Препарат накрыть покровным стеклом и микроскопировать в сухой системе (Шадрина, 2007).
Окраска волютина в клетках бактерий
Способ А:
1. Фиксированный мазок окрасить метиленовым синим 3-5 мин.
2. Промыть мазок водой, высушить.
3. Микроскопировать в иммерсионной системе (Сопрунова, 2006).
Способ Б:
Метод Омелянского1. На обезжиренном предметном стекле приготовить тонкий мазок.
2. Мазок высушить на воздухе и зафиксировать над пламенем горелки.
3. На фиксированный мазок нанести карболовый фуксин Циля и окрашивать клетки 0,5-1мин.
4. Краску слить, препарат промыть водой и обесцветить 20-30 сек 1%-м раствором H2SO4.
5. Кислоту слить, препарат промыть водой и высушить.
6. Препарат микроскопировать в иммерсионной системе (Шадрина, 2007).
Окраска жировых включений бактерий
1. В каплю водной взвеси бактерий на предметное стекло добавить каплю раствора Судан III.
2. Материал накрыть покровным стеклом.
3. Микроскопировать в сухой системе (Шадрина, 2007).
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Культуральные и морфологические признаки
Культуральные признаки штамма Ochrobactrum (рис. 4) изучали визуально: рост по штриху – сплошной с ровным краем, колония светло-бежевого цвета, с ровным краем, поверхность колонии гладкая, профиль – бугристый, структура однородная, консистенция сметанообразная.
Рисунок 4. Культуральные признаки штамма Ochrobactrum
Морфологические признаки – размер и форма клеток изучали при помощи окулярного микрометра. Штамм Ochrobactrum представляет собой палочки с параллельными сторонами и закругленными концами, как правило одиночные. Клетки примерно 0,6-1,2 до 2 мкм в длину.
3.2 Цитологические признаки
Определение грам-типа штамма Ochrobactrum определяли при помощи двух методов – окраски клеточной стенки по способу Грама (рис. 5) и экспресс-методом, с использованием 3 % раствора КОН.

Рисунок 5. Окраска по способу ГрамаОкраска по способу грама показала, что изучаемая бактерия является грамотрицательной, повторный экспресс-метод подтвердил данные физиологические особенности: показав тянущийся за петлей след от исследуемой бактерии.
Так же штамм Ochrobactrum был подвержен окраске по Циль-Нильсону, дабы проверить свойства кислотоустойчивости. В результате, исследуемый штамм изменил окраску на красно-оранжевую, которая показала, что данный штамм является кислотоустойчивым. Окраску жгутиков проводили с помощью двух методов – по методу Леффлера в модификации Пешкова и по методу Уварова.
Эксперимент по окраске доказал, что данный штамм является неспорообразующим организмом.
При проверки культуры на подвижность, были выявлены хаотичные движения бактерий, за счет перетрихиальных жгутиков (Рис. 6).

Рисунок 6. Перетрихтальные жгутики бактерии Ochrobactrum.
Для обнаружения капсул, слизистых слоев и чехлов, проводили окрашивание мазка по методу Бурри-Гинса. В ходе эксперимента было отмечено, что некоторые клетки обладают слизистыми капсулами. (Рис. 7)
Рисунок 7. Капсула штамма Ochrobactrum
Окраска нуклеотида клеток не дала результата, так как окраски реагентом не происходило.
Гранулы гликогена (рис. 8) выявляли при окрашивании клеток штамма Ochrobactrum люголем.
Спустя некоторое время после окраски, в клетках бактерии были обнаружены красно-коричневые гранулы гликогена.

Рисунок 8. Гранулы гликогена
Окраску волютина осуществили при помощи двух способов – способа А и способа Б – метод Омелянского.
В ходе исследования, зёрна валютина в клетках не были обнаружены.
Окрашивание жировых включений в клетках штамма Ochrobactrum осуществили при помощи раствора Судана III (рис.9.).

Рисунок 9. Окраска жировых включений
В результате окрашивания цитоплазма клеток приобрела бледно-синий цвет, однако жировых включений выявлено не было.
Следующим шагом стало приготовление препарата под названием: «Агаровая пленка» (Рис. 10).


Рисунок 10. Препарат «микрокультура» (или «агаровая пленка»)
В ходе исследования, наблюдали развитие микроколонний штамма.
ВЫВОДЫ
Систематическое положение штамма Ochrobactrum sp. Относится к царству Bacteria, тип Proteobacteria, класс α-proteobacteria, порядок Rhizobiales, cемейство Brucellaceae, род Ochrobactrum.
Культуральные особенности изучаемого штамма: рост по штриху – сплошной с ровным краем, колония светло-бежевого цвета, с ровным краем, поверхность колонии гладкая, профиль – бугристый, структура однородная, консистенция сметанообразная.
По тинкториальному признаку клеточная стенка исследуемого штамма граммотрицательная.
Морфологические признаки штамма Ochrobactrum следующие: Род Ochrobactrum представляет собой палочки с параллельными сторонами и закругленными концами, как правило, одиночные. Клетки примерно 0,6-1,2 до 2 мкм в длину.
3. Штамм Ochrobactrum sp. некислотоустойчив, подвижен за счет перетрихиальных жгутиков, имеет внутриплазматические гранулы гликогена, не имеет спор, зерен валютина и жировых включений.
Список литературы
Нетрусов А. И. Практикум по микробиологии.–М.: Издательский центр «Академия», 2005. – 608 с.
Сопрунова, О. Б.  Учебно-методическое пособие «Общая бактериология. Методы цитохимических исследований». – Астрахань : Издательство АГТУ, 2006. – 64 с.
Теппер Е. З. Практикум по микробиологии. – М.: Дрофа, 2004. – 256 с.
Шадрина, О. И. Методические указания по проведению лабораторных работ по дисциплине «Цитология микроорганизмов» для студентов специальности 020209.65 «Микробиология» – Астрахань: Издательство АГТУ, 2007. – 32 с.
Егоров Н. С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. – М.: Издательство МГУ, 1995. – 224 с.
Определитель бактерий Берджи: [под ред. Дж. Хоулт]: [пер. с англ.].- М.: Изд. «Мир», 1980. - 495 с.
Patrick S. G. Chain, Dorothy M. Lang, Diego J. Comerci, Stephanie A. Malfatti, Lisa M. Vergez, Maria Shin, Rodolfo A. Ugalde, Emilio Garcia, Marcello E. Tolmasky. Genome ofOchrobactrum anthropi ATCC 49288T a Versatile Opportunistic Pathogen and Symbiont od Several Eukaryotic Hosts. Journal of Bacteriology 2011.
Adrian Kettaneh, Francois-Xavior Weill, Isabelle Poilane, Oliver Fran, Michel Thomas, Jean-Louis Herrmann, Laurent Hocqueloux. Septic Shock Caused by Ochrobactrum anthropi in an Otherwise Healthy Host. J. Clin Microbiol 2003.
Alnor D, Frimodt-Moller N, Espersen F, Frederiksen W. Infections with the Unusual Human Pathogens Agrobacterium Species and Ochrobactrum anthropi. Clinical Infectious Diseases 1994. doi: 10.1093/clinids/18.6.914
 Mahmood MS, Sarwari AR, Khan MA, Sophie Z, Khan E, Sami S. Infective Endocarditis and Septic Embolization with Ochrobactrum anthropi: case report and review of literature. The Journal of Infection 2000.
Sara Romano, Fabian Aujoulat, Estelle Jumas-Bilak, Anges Masnou, Jean-Luc Jeannot, Envold Falsen, Helene Marchandin, Corinne Teyssier. Multilocus Sequence Typing Supports the Hypothesis that Ochrobactrum anthropi Displays a Human-Associated Subpopulation. BMC Microbiology 2009.
B. Holmes, M. Popoff, M. Kiredjian, M. Kersters. Ochrobactrum anthropi gen. nov., sp. nov. from Human Clinical Specimens and Previously Known as Group Vd. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2012.
https://microbewiki.kenyon.edu
http://www.thewatchers.us
http://www.wikigenes.org
http://www.labome.org
https://www.researchgate.net
X