Седиментация Центрифугирование Ультроцентрифуги..

Формат документа: doc
Размер документа: 0.47 Мб




Прямая ссылка будет доступна
примерно через: 45 сек.



  • Сообщить о нарушении / Abuse
    Все документы на сайте взяты из открытых источников, которые размещаются пользователями. Приносим свои глубочайшие извинения, если Ваш документ был опубликован без Вашего на то согласия.

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
Кафедра биофизики





РЕФЕРАТ

СЕДИМЕНТАЦИЯ. ЦЕНТИФУГИРОВАНИЕ. УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ




студента III курса
Кашина Ивана
Александровича






МИНСК 2010
Оглавление






HYPER13 HYPERLINK \l "_Toc262635947" HYPER14ВведениеHYPER13 PAGEREF _Toc262635947 \h HYPER142HYPER15
1)СедиментацияHYPER13 PAGEREF _Toc262635948 \h HYPER144HYPER15
2) Центрифугирование и ультрацентрифугирование.HYPER13 PAGEREF _Toc262635949 \h HYPER1412HYPER15
Список литературыHYPER13 PAGEREF _Toc262635950 \h HYPER1422HYPER15
HYPER15

Введение
В грубодисперсных системах с частицами, плотность которых значительно больше плотности среды, частицы оседают под действием силы тяжести намного быстрее, чем они смещаются в результате броуновского движения.
Оседание частиц в поле тяготения, называемое седиментацией, используется для определения их размеров, фракционирования систем и для других целей. Но седиментационный принцип анализа справедлив для водных суспензий, имеющих частицы размером от 0,1 до 100 мкм, так как для этих частиц время нарастания скорости оседания до постоянного значения настолько мало, что не оказывает влияния на результаты седиментационного анализа. К частицам радиусом больше 100 мкм, в обычных условиях оседающим ускоренно, и к частицам радиусом меньше 0,1 мкм, содержащимся в кинетически устойчивых системах, уравнение неприложимо. Поэтому обычный седиментационный анализ в этом случае непригоден.
Центрифугирование — разделение неоднородных систем (напр., жидкость — твердые частицы) на фракции по плотности при помощи центробежных сил. Центрифугирование осуществляется в аппаратах, называемых центрифугами. Центрифугирование применяется для отделения осадка от раствора, для отделения загрязненных жидкостей, производится также центрифугирование эмульсий (напр., сепарирование молока).
Ультрацентрифугирование (от лат. ultra – сверх, за пределами) - разделение неоднородных смесей на составные части под действием огромной центробежной силы. Лабораторные ультрацентрифуги применяют для изучения седиментации, разделения частиц размером менее 100 нм (коллоидных систем, молекул белков, нуклеиновых кислот, синтетических полимеров).
Два этих метода являются достаточно близкими и их можно рассматривать как методы расширения границ применения седиментационного принципа анализа. В этой работе рассматриваются теоретические основы и практическая реализация перечисленных выше методов.

Седиментация
Рассмотрим, как оседает в жидкости отдельная частица суспензии.
Оседание частицы происходит под действием силы тяжести f, которая с учетом на потерю в весе, по закону Архимеда, составляет:
(1)
где v — объем частицы; ρ — плотность вещества частицы; ρ0— плотность среды; g—ускорение свободного падения.
Оседанию противодействует сила трения f’:
(2)
где В — коэффициент трения между частицей и средой; и — скорость седиментации частицы.
Вначале частица движется ускоренно, так как при малых скоростях сила тяжести превышает силу трения. По мере увеличения скорости движения сила трения возрастает и в некоторый момент уравновешивает силу тяжести, вследствие чего частица начинает двигаться с постоянной скоростью. При стационарном режиме оседания, очевидно, должно соблюдаться равенство:
(3)

Применительно к сферическим частицам, используя закон Стокса, это уравнение принимает вид

, (4)
где — вязкость среды.
Из уравнения (4) легко найти скорость седиментации частицы:
, (5)
Согласно уравнению (5) скорость седиментации частицы прямо пропорциональна квадрату радиуса (или диаметра) частицы, обратно пропорциональна вязкости среды и зависит от разности так, что при происходит оседание, а при (например, суспензия парафина в воде) всплывание частиц — обратная седиментация.
Из уравнения (3) легко также найти радиус частицы, зная скорость ее оседания и значение величин , и :
, (6)
Уравнение (3) справедливо для водных суспензий, имеющих частицы размером от 0,1 до 100 мкм, так как для этих частиц время нарастания скорости оседания до постоянного значения настолько мало, что не оказывает влияния на результаты седиментационного анализа. К частицам радиусом больше 100 мкм, в обычных условиях оседающим ускоренно, и к частицам радиусом меньше 0,1 мкм, содержащимся в кинетически устойчивых системах, уравнение (3) неприложимо. Поэтому обычный седиментационный анализ в этом случае непригоден.
Рассмотрим теперь седиментацию дисперсных систем, состоящих из множества частиц. При этом примем, что частицы в таких суспензиях оседают совершенно независимо друг от друга.
В монодисперсной системе, поскольку скорость оседания одинаковых по размеру частиц одинакова, отстаивание будет происходить равномерно (высота слоя осветленной жидкости пропорциональна времени оседания τ). При этом граница раздела отстоявшейся концентрированной суспензии и прозрачной среды будет смещаться на некоторое расстояние. Тогда скорость оседания и выразится уравнением:
(7)
а радиус частиц уравнением:
, (8)
где
, (9)
По уравнению (8) легко вычислить радиус частиц суспензии по результатам наблюдения за ее оседанием визуально. Скорость седиментации монодисперсной суспензии можно определить, наблюдая за оседанием какой-нибудь одной из ее частиц в микроскоп.
При отстаивании полидисперсной суспензии в отличие от монодисперсной граница оседающего слоя оказывается размытой, так как частицы, имеющие различные радиусы, проходят за одно и то же время различные пути. Поэтому седиментационный анализ полидисперсной системы сводится к определению скорости накопления осадка.
Способы установления зависимости между массой выпавшего осадка т и временем оседания τ, графически изображаемые так называемой кривой седиментации, из которой получают необходимые данные для характеристики полидисперсности исследуемой системы, подробно рассматриваются в практикумах по коллоидной химии.

При вычислении размера частиц, исходя из кривой седиментации, характеризующей содержание в полидисперсных системах частиц различного размера, помимо классического графического метода расчета, предложенного Свеном Оденом, применяются аналитические методы построения кривых седиментации, разработанные Н. Я. Авдеевым и Н. Н. Цюрупой.
По результатам, полученным при обработке кривой седиментации, обычно строят кривую распределения, наглядно показывающую весовое содержание Q в суспензии различных фракций. Для этого строят диаграмму, на оси абсцисс которой откладывают значения радиусов частиц r, на оси ординат — значения Q/Δr для каждой фракции. Пример такой диаграммы приведен на рисунке 1. Тогда QΔr/Δr = Q и весовое содержание каждой фракции выразится площадью соответствующего прямоугольника. Построив такие прямоугольники для всех фракций и соединив плавной линией средние точки их верхних сторон, получают кривую распределения. Фракция, отвечающая максимуму кривой распределения, называется преимущественной фракцией полидисперсной суспензии, так как очевидно, что частиц, составляющих эту фракцию, в системе больше всего (на рисунке 1 эта фракция IV с частицами, радиус которых лежит в пределах от r4 до r5).

Рисунок 1 - Построение кривой распределения

Кривые распределения являются важной характеристикой дисперсных систем. Чем уже интервал радиусов кривой распределения и чем выше ее максимум, тем суспензия ближе к монодисперсной. Наоборот, чем кривая более растянута и чем ниже максимум, тем суспензия более полидисперсна. На рисунке 4 для примера приведены кривые распределения четырех различных типов.

Рисунок 4 – Кривые распределения
1— система, наиболее приближающаяся к монодисперсной; 2 —наиболее полидисперсная система; 3, 4 — системы, содержащие соответственно преимущественно мелкие частицы (максимум сдвинут влево) и крупные частицы (максимум сдвинут вправо).
Остановимся теперь кратко на экспериментальных приемах, используемых при седиментационном анализе полидисперсных систем.
Весовая модификация седиментационного анализа заключается в определении скорости накопления осадка на чашке весов. Для этой цели были предложены седиментационные весы самых разнообразных конструкций. Наиболее распространенными седиментационными весами является прибор Н. А. Фигуровского, предложенный им в 1936 г. Этот прибор на рисунке 5 представляет собою закрепленный в горизонтальном положении в держателе штатива 1 гибкий стеклянный или кварцевый шпиц 2, на конец которого подвешивают на стеклянной нити тонкостенную стеклянную чашечку 3. Расстояние между уровнем жидкости и подвешенной чашечкой обозначено через Н. При погружении чашечки в цилиндр с испытуемой суспензией на чашечке постепенно накапливается осадок и шпиц прогибается. За прогибом шпица следят при помощи отсчетного микроскопа. Отмечая во времени перемещения конца шпица по микрошкале, строят график изменения величины прогиба шпица во времени. Так как при прогибе шпица имеет место подчинение закону Гука, то полученный график выражает зависимость массы осадка т от времени τ, т. е. т =f (τ). Вместо того, чтобы подвешивать чашечку к концу гибкого шпица, ее можно укрепить к коромыслу торзионных весов. При этом за накоплением осадка следят по перемещению стрелки на циферблате весов.

1 – держатель штатива, 2 – шприц, 3 – чашечка.
Рисунок 5 – Седиментометр Фигуровского

Другой метод наблюдения за ходом седиментации полидисперсных систем предложен Вигнером в 1918 г. Этот метод основан на измерении гидростатического давления столба суспензии при выделении из нее дисперсной фазы в результате седиментации. Седиментация по этому методу проводится в специальном приборе — седиментометре Вигнера (рисунок 6).

1 — трубка для суспензии;
2 —трубка для дисперсионной среды.
Рисунок 6 - Седиментометр Вигнера:

При закрытом кране, соединяющем оба колена прибора, в широкую трубку заливают суспензию, а в узкую трубку 2 вводят дисперсионную среду, затем кран открывают. Вначале уровень жидкости в трубке 2 выше, чем в трубке 1, так как средняя плотность суспензии обычно больше, чем плотность среды. Однако по мере выпадения дисперсной фазы суспензии и накопления осадка на дне трубки 1, плотность суспензии будет постепенно приближаться к плотности среды и разность уровней жидкости h в обоих коленах будет уменьшаться. Зависимость h от времени седиментации можно использовать для построения кривой седиментации.
Весьма интересный метод седиментационного анализа, хотя и требующий довольно сложного оборудования, разработали Н. А. Фигуровский и Т. Б. Гаврилова. Эти авторы применили для оседания дисперсной фазы сконструированные ими автоматические центробежные приборы, позволяющие определять размеры частиц высокодисперсных систем (до 0,05 мкм при плотности дисперсной фазы 2—4 г/см3). С помощью этих приборов можно изучать кинетику оседания частиц и затем получать кривую распределения частиц по размерам.
В заключение следует отметить ряд условий, ограничивающих применимость седиментационного анализа. Во-первых, основное уравнение седиментационного анализа (4) пригодно только для расчета размера сферических частиц. Для частиц, отличающихся по форме от сферических, уравнение (4) позволяет определить только так называемый эффективный, или эквивалентный радиус, т. е. радиус воображаемых сферических частиц, обладающих той же плотностью и оседающих с той же скоростью, что и частицы суспензии. Во-вторых, при седиментационном анализе с использованием уравнения (4) можно получить правильные результаты только в том случае, если частицы не сольватированы. Понятно, что влияние сольватации будет сказываться в тем большей степени, чем меньше размер частиц. Наконец, в-третьих, седиментационный анализ можно применять только тогда, когда частицы оседают раздельно друг от друга (когда концентрация системы не слишком велика) и когда они не образуют агрегатов.

2) Центрифугирование и ультрацентрифугирование.
Как уже указывалось, под действием гравитационного поля оседают только достаточно крупные частицы. Коллоидные частицы под действием силы тяжести не седиментируют или седиментируют чрезвычайно медленно. Так, частицы кварца радиусом 0,1 мкм проходят при оседании путь в 1 см за 86,2 ч. Однако, заменяя гравитационное поле действием центрифуги с гораздо большим ускорением, в сотни тысяч раз превышающим ускорение свободного падения, можно заставить оседать достаточно быстро и коллоидные частицы. В частности, в центробежном поле с ускорением 105 g та же суспензия кварца должна оседать на 1 см всего за 3 с.
Использовать ультрацентрифугу для определения размера коллоидных частиц впервые в 1910 г. предложил А. В. Думанский. Шведский ученый Сведберг широко использовал эту идею, он разработал ряд конструкций ультрацентрифуг для определения размера коллоидных частиц и молекул высокомолекулярных веществ, например белков.
Принципиальное устройство ультрацентрифуги показано на рисунке 7. На приводимую в движение ось центрифуги 1 надет ротор 2 — массивный диск, в котором имеются радиальные вырезы. В эти вырезы вставляются прочные кварцевые кюветы 3, в которые наливают исследуемую коллоидную систему. Ротор ультрацентрифуги, вращающийся с большой скоростью (десятки тысяч оборотов в минуту), окружен кожухом 4. В отдельных местах кожуха сделаны окошки, соответствующие вырезам ротора. Под нижним окошком кожуха помещен источник света 6, а над верхним окошком кожуха — фотокамера 5. При длительном вращении коллоидные частицы, если их плотность больше плотности среды, отбрасываются центробежной силой к периферии. В результате этого в кювете появляется ближе к периферии слой концентрированного золя и ближе к оси вращения — слой осветлившейся жидкости. По мере центрифугирования первый слой уменьшается, а второй — увеличивается, пока не установится седиментационное равновесие или пока все частицы не осядут на дно. Путем фотосъемки через определенные промежутки времени можно проследить за передвижением границы между двумя слоями. Схематически эти снимки показаны на рисунке 8.

Рисунок 7. Принципиальное устройство ультрацентрифуги:
i — ось; 2—ротор; 3 — кварцевые кюветы; 4 — кожух; 5 — фотокамера; 6 — источник света.




Рисунок 8 - Перемещение границы золь — дисперсионная среда в кюветах ультрацентрифуг при центрифугировании.
При центрифугировании полидисперсной системы четкой границы, конечно, не образуется. Однако полученные снимки позволяют установить распределение концентраций дисперсной фазы в кювете.
При исследовании бесцветных и прозрачных золей перемещение границы или распределение концентраций в кювете приходится определять не с помощью обычных фотоснимков, а путем наблюдения за коэффициентом преломления золя в различных участках кюветы.
По данным, полученным тем или иным способом, можно вычислить скорость седиментации или найти седиментационное равновесие. На основании этого, в свою очередь, можно рассчитать молекулярный вес или размер частиц, подвергающихся седиментации.
Рассмотрим более подробно определение размера частиц по скорости седиментации в ультрацентрифуге. Для расчетов применимо уравнение, в общем сходное с обычным седиментационным уравнением (3). Однако поскольку при центрифугировании частицы, постепенно удаляясь от оси вращения, двигаются с переменной все возрастающей скоростью, в уравнении величина и должна быть заменена на dx/dτ (где х — расстояние частицы от оси вращения). В то же время из механики известно, что ускорение в поле центрифуги равно ω2х (где ω— угловая скорость). Тогда, очевидно, уравнение (3) в применении к ультрацентрифуге можно написать следующим образом:
(9)
Разделяя переменные и интегрируя от x1 до х2 и соответственно от 0 до τ, можно получить:

(10)
Принимая, что частицы имеют сферическую форму, и подставив соответствующее значение для В, получим:

Решая это уравнение относительно r, можно написать:
(11)
Уравнение (11) можно представить таким образом, что в правой части его будут находиться все постоянные величины, характеризующие исследуемую систему:

(12)
Выражение называют константой седиментации и обозначают через S. Константа седиментации может служить мерой седиментируемости данной системы.
Если известен коэффициент диффузии, то из соотношений D = kT/B для диффузии и уравнения S = т/В можно исключить В и найти массу т, а следовательно, и численный или молекулярный вес. Такой способ определения численного или молекулярного веса особенно пригоден для систем, содержащих частицы, сильно отличающиеся по своей форме от сферической или сильно сольватированные. Это связано с тем, что величины S и D одинаково зависят от формы и степени сольватации частиц.
Размер коллоидных частиц, как уже указывалось, можно найти не только по скорости седиментации в ультрацентрифуге, но и определяя седиментационное равновесие. Для этой цели применяют центрифугирование при не слишком больших частотах вращения (обычно около 20 000 об/мин), так как иначе превалировала бы седиментация и равновесие не устанавливалось. Численный или молекулярный вес, найденный по седиментационному равновесию, отвечает равновесному распределению частиц в системе, он не зависит от способа достижения этого распределения, и, следовательно, на результатах анализа не может сказываться форма частиц и их сольватация.
Комбинируя определение скорости седиментации с определением седиментационного равновесия, можно найти и кривую распределения частиц, если центрифугированию подвергается полидисперсная система. Сравнение результатов седиментации в ультрацентрифуге по обоим методам позволяет также судить и о форме частиц.

Уравнение Ламма.
Рассмотрим поток вещества в ультроцентрифужной ячейке, проходящей через поверхность отстоящую на расстоянии х от оси вращения.

Рисунок 8 – Схема потоков диффузии и седиментации в ультроцентрифужной ячейки

Поток обусловленный диффузией выражается законом Фика
Седиментационый поток может быть выражен через скорость v седиментирующих частиц
Тогда общий поток через поверхность отстоящую на расстоянии x от оси вращения



Через поверхность отстоящую на расстоянии x+xd от оси вращения

Скорость можно выразить через константу седиментации

Вычитая из первого уравнения второе, пренебрегая величинами второго порядкамалости () и учитывая, что

получим
При выводе использовались общие производные от с по х и t, но конечно же предполагалось, что дифференцирование по х или только по t и при этом вторая переменная остаётся постоянной. Тогда более правильно будет записать последнее уравнение в виде



Это уравнение называется уравнением Ламма или основным уравнением ультроцентрифугирования. Решив его, можно определить концентрацию в любом месте центрифужной ячейке в любой момент времени.


Виды центрифугирования
Дифференциальное центрифугирование. Метод основан на различиях в скоростях седиментации частиц, отличающихся друг от друга размерами и плотностью. Разделяемый материал, например, гомогенат ткани, центрифугируют при ступенчатом увеличении центробежного ускорения, которое выбирается так, чтобы на каждом этапе на дно пробирки осаждалась определенная фракция. В конце каждой стадии осадок отделяют от надосадочной жидкости и несколько раз промывают, чтобы в конечном итоге получить чистую осадочную фракцию. К сожалению, получить абсолютно чистый (гомогенный) осадок практически невозможно. Дифференциальное центрифугирование суспензии частиц в центробежном поле

Рисунок 9 - Дифференциальное центрифугирование
Сначала все частицы гомогената распределены по объему центрифужной пробирки равномерно см. рисунок 9 (а), поэтому получить чистые препараты осадков самых тяжелых частиц за один цикл центрифугирования невозможно: первый образовавшийся осадок содержит в основном самые тяжелые частицы, но, кроме этого, также некоторое количество всех исходных компонентов. Получить достаточно чистый препарат тяжелых частиц можно лишь при повторном (двух- или трехкратном) суспендировании и центрифугировании исходного осадка. Дальнейшее центрифугирование супернатанта при последующем увеличении центробежного ускорения приводит к седиментации частиц средних размеров и плотности, а затем и к осаждению самых мелких частиц, имеющих наименьшую плотность.
Дифференциальное центрифугирование является, по-видимому, самым распространенным методом выделения клеточных органелл из гомогенатов тканей. Наиболее успешно применяется этот метод для разделения таких клеточных органелл, которые значительно отличаются друг от друга по размерам и плотности.
Центрифугирование в градиенте плотности
Макромолекулы или органеллы, незначительно различающиеся по размеру или по плотности, можно разделить центрифугированием в градиенте плотности. Для этих целей используются два метода.
При зональном центрифугировании анализируемая проба (например, белки или клетки) наслаивается тонким слоем поверх буферного раствора. В процессе центрифугирования частицы проходят через раствор, так как их плотность выше плотности раствора. Скорость движения зависит от массы и формы частиц (см. формулы на схеме А).

Рисунок 10 – зональное центрифугоирование
Центрифугирование прекращают прежде, чем частицы достигнут дна центрифужной пробирки. Затем дно прокалывают и собирают ряд фракций, содержащих различные частицы. Стабильность градиента плотности в процессе центрифугирования достигается применением растворов углеводов или коллоидного силикагеля, концентрация которых возрастает от поверхности к дну пробирки. Градиент плотности препятствует образованию конвекционных потоков, снижающих качество разделения. Метод зонально-скоростного центрифугирования применяется для разделения гибридов РНК — ДНК, субъединиц рибосом и других клеточных компонентов.
При изопикническом центрифугировании пробу (например ДНК, РНК или вирусы) равномерно распределяют во всем объеме раствора (обычно CsCI). В этом случае разделение продолжается значительно дольше, чем при зональном центрифугировании. Градиент плотности создается в процессе центрифугирования за счет седиментации и диффузии. Со временем каждая частица попадает в область, соответствующую ее собственной плавучей плотности.
Изопикническое центрифугирование проводят как в градиенте плотности, так и обычным путем. Если центрифугирование проводится не в градиенте плотности, препарат сначала центрифугируют так, чтобы осели частицы, молекулярная масса которых больше, чем у исследуемых частиц. Эти тяжелые частицы отбрасывают
Перед началом центрифугирования суспензию частиц наслаивают поверх градиента плотности жидкости (а); при скоростном центрифугировании частицы не достигают изопикнической точки, а при изопикническом разделении центрифугирование продолжают до тех пор, пока исследуемые частицы не достигнут зоны с соответствующей плотностью (б) и образец суспензируют в среде, плотность которой такая же, как и у фракции, которую хотят выделить, а затем центрифугируют до тех пор, пока исследуемые частицы не осядут на дно пробирки, а частицы меньшей плотности не всплывут на поверхность жидкости
Изопикническое разделение без градиента плотности.


Рисунок 11 – Изопикническое центрифугирование

Перед центрифугированием частицы распределены по объему центрифужной пробирки равномерно (а); после центрифугирования более легкие частицы всплывают наверх, в то время как тяжелые оседают на дно пробирки (б)

Эта особенность используется при количественном разделении лизосом, митохондрий и пероксисом, основанном на удалении из гомогенной среды всех частиц с большей, чем у микросом, плотностью и последующем изопикническом центрифугировании выпавших в осадок тяжелых частиц.



Современная ультрацентрифуга представляет собою сложный прибор, конструкция которого обеспечивает равномерное вращение ротора и отсутствие вибраций, исключает малейшие температурные колебания в кювете и т. д. В новейших ультрацентрифугах ротор диаметром всего в несколько сантиметров, изготовленный обычно из хромоникелевой стали, вращается в токе разреженного водорода. Водород, обладающий высокой теплопроводностью, обеспечивает быстрый отвод тепла, выделяющегося вследствие трения, и таким образом уменьшает возможность тепловой конвекции в кювете. Такие ультрацентрифуги приводятся во вращение с помощью масляных турбин. Существуют и воздушные ультрацентрифуги, ротор которых приводится во вращение и поддерживается во взвешенном состоянии потоком воздуха.
Следует отметить, что в последнее время ультрацентрифуги начинают использоваться не только для определения численного или молекулярного веса дисперсных систем, но и для чисто препаративных целей, например, для разделения смесей высокомолекулярных соединений в растворах на отдельные, фракции, отличающиеся размером молекул.

Список литературы


С.С. Воюцкий Курс коллоидной химии М. 1975
Ю.Г. Фролов Курс коллоидной химии М. 1989
Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование М. Наука -1981

























X